融合型甲基对硫磷水解酶的表达、纯化及酶活测定

1、 毕 业 设 计（论 文）题 目 融合型甲基对硫磷水解酶的表达、纯化及酶活测定姓 名 学 号 所在学院 生物工程学院 专业班级 指导教师 日 期 毕业设计（论文）摘 要人们发现环境中的微生物能够降解以甲基对硫磷为代表的有机磷农药，这为消除有机磷农药造成的污染提供了更好的途径。本论文目的：对融合型甲基对硫磷水解酶的表达、纯化及酶活测定进行研究。为甲基对硫磷水解酶制剂的生产、应用及深入研究该酶的分子结构、作用机制等奠定了基础。实验方法：菌种扩大培养，经IPGE诱导表达。细胞破碎与粗酶提取。用Ni-NTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。蛋白电泳检测，酶液透析纯化。采用BCA法测定蛋白浓度，和酶标仪检测酶活及酶动力学参数的测定。结论：得到纯化的融合型酶，且融合型酶仍然保持着野生型的活性。关键词：甲基对硫磷水解酶；蛋白表达纯化；酶活性AbstractPeople found the bacterium in natural environment with the capability of degrading organophosphate pesticides, which pr

2、ovided us a good way to eliminate the pollution of organophosphate pesticides. Purpose of this thesis: The expression, purification and characterization of the MPH for the further study on its molecular structure, mechanism of catalysis and applications. The experiment: Methyl parathion hydrolase was expressed in E.coli. The fusion protein was purified to homogeneity by Ni-affinity chromatography; the protein could degrade methyl parathion effectively. The protein concentration was assayed by BC

3、A. Enzyme activity was detected by UV-vis and microplate, and enzyme kinetic parameters were determined. Conclusion: The pure fusion enzyme was obtained and it remained wild-types activity.Keywords: methyl parathion hydrolase；protein expression and purification；enyme kinetics目 录摘 要IAbstractII目 录III第一章 综述11.1 有机磷农药11.1.1 有机磷农药的概述11.1.2 有机磷农药的作用及危害11.2 微生物降解有机磷农药的研究进展21.2.1 有机磷农药的降解21.2.2 降解有机磷农药的微生物的种类及筛选21.2.3 微生物降解有机磷农药的降解机理与代谢途径41.3 甲基对硫磷水解酶51.4 酶活力测定方法61.4.1 按反应时间分类法61.4.2 按监测方法分类法71.5 选题的目的、

4、意义10第二章 实验112.1 材料112.1.1 菌种112.1.2 主要药品及试剂112.1.3 仪器与设备112.1.4 培养基与缓冲液122.2 实验方法122.2.1 菌种的扩大培养与诱导表达132.2.2 细胞破碎与粗酶提取132.2.3 分离纯化142.2.4 蛋白质电泳检测152.2.5 酶液透析纯化162.2.6 提取酶液的蛋白质检测162.2.7 酶标仪检测酶活172.2.8 酶动力学参数的测定17第三章 结果与分析193.1 甲基对硫磷水解酶的表达193.2 酶的纯化193.3 提取酶液的蛋白质检测203.4 酶标仪检测酶活213.5 酶动力学参数的测定213.5.1 酶标仪测量酶动力学参数213.5.2 紫外分光光度计测量酶动力学参数23第四章 讨论264.1 野生型菌株与融合型菌株264.2 有关酶活的几个定义264.2.1 Km264.2.2 Kcat274.2.3 U274.2.4 比活力274.2.5 本实验所得酶动力学参数274.3 后续工作设想27致谢29参考文献30IV毕业设计（论文）第一章 综述1.1 有机磷农药1.1.1 有机磷农药的概述 有机

5、磷是农药主要类别之一，几乎遍及农药所有领域1。目前，世界上有机磷农药商品已经达到上百种，尤其在杀虫剂方面居首。 所有有机磷农药含有共同的基本结构2，化学结构如图1.1所示。 图1.1 有机磷农药结构示意图通常R1、R2为烷基、芳基、烃基或其他基团，Y为氧或硫原，X为卤素、脂肪酸、芳香族或杂环基团，它通过氧或硫原子与磷原子连接构成离去基团，被磷酸三酯酶水解时该基团从磷原子处释放正是有机磷农药的命名原因。1.1.2 有机磷农药的作用及危害 甲基对硫磷是一种高效、高毒的有机磷酸酯类杀虫剂，广泛应用于农业生产、植物保护的过程中。可是它对人类和非目标有机体的损害巨大，已造成严重的全球性环境污染和生态破坏3。甲基对硫磷能够强烈抑制乙酰胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱不能分解为乙酸和胆碱。造成乙酰胆碱堆积，从而引起一系列神经中毒症状4。急性中毒会导致肌肉痉挛、瞳孔收缩、呼吸困难，甚至死亡。低剂量有机磷农药可造成慢性中毒，引发神经系统，内分泌系统，生殖系统等的多种疾病5。甲基对硫磷是我国农业生产中普遍使用的农药产品之一，农药残留超标引发食品安全问题，也严重制约了农产品的出口。因而，有效降解甲基对硫磷的方法是人

6、们迫切需要找到的。 1.2 微生物降解有机磷农药的研究进展1.2.1 有机磷农药的降解 土壤中有机磷农药的降解主要分为光降解6、化学降解、微生物降解三种形式。大多数农药能够发生光降解生成新化合物，产物仍会不断分解，最终变为无毒的化合物。化学降解主要有氧化和水解，水解最为重要。 传统的物理及化学方法降解有机磷农药效果虽然不错，可成本太高，并且容易造成二次污染，所以只能作为一种辅助手段。微生物降解才是农药主要的降解途径。微生物体积微小，种类多，数量多，代谢活动旺盛，代谢类型多样，含有催化污染物转化的各种酶系。而且无处不在，在环境的物质转化里起着重要的作用7。 含有有机磷降解基因（opd )的微生物可以有效消除环境和农产品中的农药残留8。现已对有机磷水解酶（OPH）进行了包括基因改造、分泌表达9、酶的纯化10,11、高级结构分析12,13、定向进化14,15等多方面的研究。1988年，筛选出一株降解甲基对硫磷的假单胞菌(Pseudomonas sp.)，通过与同位素标记的opd的探针进行的点杂交证明其全细胞基因具有与opd的同源基因16，1994年，一株恶臭假单胞菌（Pseudomonas

7、putida）被证明能利用甲基对硫磷作为唯一的碳源17，其基因（mpd ,Methyl parathion degrading gene）已被克隆和测定序列18。1.2.2 降解有机磷农药的微生物的种类及筛选自然环境中存在许多微生物，如细菌、真菌、放线菌、藻类等对有机磷农药具有降解作用，其中对细菌和真菌了解的更多(表1.1)。土壤中残留的农药，除一部分通过热分解、光分解和化学分解外，大部分通过环境中微生物降解或转化作用，把有毒农药转化成无毒或低毒的其它化合物。表1.1 降解农药的微生物种类农药类型降解微生物参考文献甲胺磷芽孢杆菌属、假单胞菌属、嗜中温假单胞菌属、蜡样芽胞杆菌属、酵母属、青霉属、曲霉属刘斌斌等，2001对硫磷黄单胞杆菌属、芽孢杆菌属、固氮极毛杆菌属、假单胞菌属、短杆菌属、黄杆菌属、极瘤细菌属、节杆菌、青霉属、曲霉属、木霉属、小球绿藻属、不动杆菌属Kaneva,et al,1998虞云龙等，1996甲拌磷硫杆菌属、假单胞菌属、小球绿藻王永杰等，1998甲基对硫磷假单胞菌属、短杆菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、藻青菌、邻假单胞菌微藻、产碱菌属解秀平等，2006楚晓娜等，2003马

8、拉硫磷黄杆菌属、假单胞菌属、节细菌属、木霉属、曲霉属、极瘤细菌属石登荣等，2006苯硫磷敌敌畏乐果敌百虫芽孢杆菌属不动菌属、假单胞菌属、木霉属不动菌属、假单胞菌属、曲霉属、类产碱单胞菌属青霉属邓海涛等，2003付文祥等，2006陶玉贵等，2007李 荣等，2007蝇毒磷久效磷二臻磷草甘膦诺卡氏菌、放射型土壤杆菌、假单胞菌芽孢杆菌属、假单胞菌属、节杆菌属假单胞菌属、黄杆菌属无色菌属、假单胞菌属、青霉属、曲霉属、嗜热菌属田晓玲等，2001贾开志等，2007张 卫等，2004石成春等，2005由表中可知，土壤微生物对残留农药的降解，以细菌和真菌为主19。所发现的降解微生物中放线菌较少。假单胞菌及芽胞杆菌等微生物能同时降解多种农药；有些微生物通过共代谢完成降解过程20，而不直接降解农药。霉菌为真菌中的优势菌，细菌中主要有芽胞杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、黄杆菌、无色杆菌等。主要是从受该有机磷农药污染的土壤、水体底泥中获取有机磷降解菌。筛选分离方法也在不断改进：传统技术，如平板系列稀释法、直接洒土法等，可长期使用且十分稳定。但分离菌种的种类单一，效率过低，重复分离过多，浪费时间及资源21。新近采用的方法有整合树脂法、缓冲液稀释法、超声波法、分选法。Atalan等22结合现有方法，设计出一个综合的土样处理过程，称为分散和差速离心法。1.2.3 微生物降解有机磷农药的降解机理与代谢途径 微生物对农药的作用可分成两大类，一类是微生物直接作用于农药，实质为酶促反应，微生物本身含降解农药的酶系基因，或本身虽无该酶系基因，但经诱导或环境存在选择压，基因发生重组产生了新的降解酶系。主要作用方式有氧化、脱氢、还原、水解等。另一类是通过微生物的活动改变了物理化学环境而间接作用于农药。常见的作用方式有矿化作用、共代谢作用、种间协同代谢。微生物降解的过程可分成3个步骤：首先是化合物在微生物细胞膜表面的吸附，这是一个动态平衡；其次是吸附在细胞膜表面的化合物进入细胞膜内；最后

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