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水稻和大麦耐盐性的比较基因组学研究

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  • 卖家[上传人]:wo7****35
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    • 1、水稻和大麦耐盐性的比较基因组学研究 摘要:大麦(Hordeum vulgare L.)是最耐盐的禾本科作物之一,其野生种质中蕴含丰富的耐性基因资源,这些基因通过各种分子机制调控植株的耐盐性。然而,水稻是禾本科作物中耐盐差的物种之一。但大麦和水稻在基因组序列及其表达模式上具有高度相似性。这些基因往往较保守,在生长中具有功能显著性和等效性,称为共有基因,含有一些转录因子、酶家族、结构蛋白等,这些基因的作用可能与耐盐性相关。本实验选用以水稻日本晴(Oryza sativa subsp. Japonica)和西藏野生大麦XZ26(Hordeum vulgate subsp. spontaneum)为代表材料,用转录组测序寻找盐胁迫下大麦与水稻基因组中响应盐胁迫的共有基因和物种间特异表达基因,结合对应的耐盐表型与元素含量进行分析,初步探索大麦和水稻基因组与耐盐性的关系,从基因层面揭示大麦和水稻物种间耐盐的相关机理,为水稻耐盐性改良提供理论参考。关键词:盐胁迫;差异表达基因;表现型;元素含量; 转录组测序。Comparative genomics analysis of salt toleranc

      2、e between rice and barley Abstract: Among gramineous crops, barley (Hordeum vulgare L.) is one of the most salt-tolerant species, which contains rich resources of salt-tolerance genes regulating salt tolerance of plants in its wild germplasm. However, rice is salt sensitive. Barley and rice have high similarity in the genome sequences and the expression pattern of genes. These conservative genes in barley and rice (cBR genes) including transcription factors, enzyme families, structural proteins

      3、maintain the law of growth regulation, which playing important roles in salt tolerance. In this study, rice cultivar Nipponbare (Oryza sativa subsp. Japonica) and a Tibetan wild barley XZ26 (Hordeum vulgate subsp. Spontaneum) were selected for this research. The cBRs differently regulated in rice and barley under salt stress were identified through RNA-seq. Then the correlation between cBRs genes and salt tolerance in barley and rice was discussed, revealing the mechanism of salt tolerance betwe

      4、en the two crops at the genome level, which could provide a valuable reference for improving and breeding in rice.Keywords: Salt stress; differentially expressed genes; phenotype; element content; RNA-seq.目 录1. 引言32. 研究背景综述3 2.1 大麦的耐盐机理3 2.2 大麦与水稻的耐盐性比较4 2.3 转录组及其测序技术(RNA-seq)43. 材料与方法43.1 实验材料53.2 植株处理与取样53.3 元素含量测定63.4 RNA提取与RNA-Seq分析63.5 数据分析84. 文献综述9 4.1 大麦和水稻耐盐性比较9 4.2 盐胁迫对大麦及水稻元素含量的影响10 4.3 盐胁迫下转录组分析145. 讨论22 5.1 响应基因的表达与耐盐性的关系22 5.2 大麦和水稻耐盐性差异的基因组层面的探讨23 5.3 研究展望及不足之处的改进23参考文献241. 引言土地盐渍化

      5、是全球农业生产所面临的严峻挑战之一,盐害的产生来源多种多样,最普遍的是植物蒸腾作用引发的地下矿质资源上升到土表,这一趋势随着全球变暖和精耕细作进一步加剧。目前,全球大约有8.31亿 hm2 的土地已受到盐渍化的威胁,而我国盐渍土面积约为3600万 hm2 3。盐害对植物的毒害作用主要有渗透抑制、矿质营养失调和离子毒害等2。水稻是我国种植面积最大、单产最高粮食作物,总产目前位居我国第二。作为主要粮食,稻米在全国居民粮食消费中占65以上。水稻的年种植面积约占全国粮食作物的30,总产量则要占40以上,建国以来,我国稻米生产有了较大的发展,总产量不断增加,为我国粮食生产做出了重大的贡献 3,29。耐盐性作为水稻品种改良方向之一,备受关注 6。水稻对于土壤盐分具有极大的敏感性,这严重威胁到了我国粮食供应,影响了农业生产,经济损失预计超过120亿 4-5。大麦是禾本科耐盐作物的代表之一,且资源分布与适应性广6。因此,研究大麦的耐盐性与水稻的盐敏感性可为揭示植物耐盐机理提供重要的参考和指导;对大麦耐盐相关基因组的研究及其与水稻的同源基因比较,将对克隆耐盐基因与培育耐盐水稻新品种提供重要的理论依据和技

      6、术支持。2. 研究背景综述2.1 大麦的耐盐机理大麦适应性广,耐盐性强,其野生抗逆种质资源丰富大麦作为一种耐盐作物 1。近年来,一些研究者对青藏高原一年生野生大麦开展了遗传多态性分析和干旱、酸铝及盐害等非生物胁迫耐性鉴定和优异种质的发掘,发现青藏高原一年生野生大麦具有丰富的遗传多态性和耐非生物胁迫的遗传变异 2,4。浙江大学大麦课题组从西藏野生大麦材料中鉴定到耐盐性具有明显差异的种质资源,如XZ16、XZ26、XZ169等,其中XZ26具有优异的耐盐性 3,23。普遍认为,渗透胁迫、离子毒害和次生胁迫是盐胁迫对植物造成危害的主要机制 1,2。如一些植物受盐胁迫时,Cl-的毒害作用往往表现在抑制植物的光合作用 6,而细胞中过多的Na+积累将导致离子失衡并产生特异性损伤。目前,渗透调节、离子平衡和抗氧化作用被认为是植物的主要耐盐机制 29。如植物在胁迫下产生大量的活性氧自由基(ROS),造成一系列次生胁迫,植物通过体内的抗氧化系统清除掉一部分的ROS,转基因植物实验研究中,过量表达抗氧化酶相关基因可增强转化植株对渗透和氧化胁迫的耐性 9。大麦耐盐机制涉及到多种生理途径与调节 2,最主要的是

      7、离子转运平衡,包括渗透调节的改善、根部Na+的摄入与Na+回流根际土壤的调节、木质部离子运输的调控、细胞中K+、Na+的置换与保留、细胞内Na+的区隔以及对氧化胁迫的耐受等 31。总体而言可被分为以下几方面:(1)Na+排出机制;(2)K+保留;(3)氧化胁迫耐性;(4)渗透调节 27,31。阐明各个机制的作用原理及其在大麦耐盐性上的相对作用,对于指导大麦及其它作物的耐盐性研究无疑具有重要的意义。2.2 大麦与水稻的耐盐性比较相比较而言,大麦与水稻大约在5000万到1亿年发生分化,具有相当悠久的历史,但在其基因组的构成乃至RNA修饰、蛋白结构乃至功能上仍然具有较高的相似性。基因若不受功能约束,其表达形式很容易变化,长久以来使萌发调节规律得以保持的水稻、大麦基因,表达序列与形式较恒定,在萌发中具有功能显著性和等效性,有较高的研究价值 23。此外,大麦中还存在特有的保守基因序列。鉴于大麦具有较强的耐盐性,而这从根本上又是由基因进行调控的,因而将耐盐性的差异划归为基因组的比较也是十分必要的。水稻栽培种的耐盐性普遍低于大麦,以水稻在盐处理下的生长状况作为参考指标,研究表明水稻幼苗期对盐碱较敏感

      8、,同一品种在发芽期和幼苗期的耐盐性存在一定差异,整个营养生长阶段,水稻耐盐性逐渐增强 5。此外,相关研究 17指出在盐碱胁迫下,水稻成熟期的株高和秆长不能很好地反映品种间耐盐性强弱,最佳取样期在分蘖期结束前,而单株分蘖数等是衡量水稻耐盐碱强弱的良好指标 4。相关研究表明,在检测到的大麦、水稻结构与功能基因中,同源数量达到57661个,大麦特有基因为4650个,即在漫长进化史中,大麦分化出少部分具有特异性的基因 2。而水稻与大麦在同源基因的蛋白质序列和表达形式上具有很高的相似性 23。基于同源基因组和大麦特异基因组的研究价值,分析特有基因在表达过程中的调控机理,比较同源基因调控差异,从中找出耐盐相关基因的可能性较高。这些基因组的分析以及文库制备等也能够成为耐盐水稻开发的一项技术储备。2.3 转录组及其测序技术(RNA-Seq)转录组是特定细胞或组织在特定时间或状态下转录出来的所有RNA的集合。通过对转录组的研究可以揭示生物体的基因表达、研究结构变异及发现新基因等。转录组分析的研究方法、研究平台发生着日新月异的变化,同时生物信息学分析的内容也在逐渐完善。分子生物学技术的快速发展极大地提高了

      9、人们对转录组(Transcriptome)的分析能力,特别是随着高通量测序技术的发展,RNA-Seq分析已经逐渐成为一种常用的实验手段 7。作为一种新的转录组研究手段,RNA-Seq利用新一代测序技术能够更为快速、准确地为人们提供更多的生物体转录信息,并在生物信息学分析等相关领域得以不断应用 10。3.材料与方法3.1实验材料本实验所用的水稻和大麦分别选取日本晴和西藏野生大麦XZ26作为实验材料。各取200粒左右具有活性的休眠种子。3.2 植株处理与取样3.2.1 种子萌发水稻种子发芽:取2个500mL的锥形瓶用去离子水洗净,各加入200mL蒸馏水,供试的的日本晴种子分别放入锥形瓶中,并标记名称,放入培养箱25饱和湿度进行暗室培养,每隔8小时换水一次,并注意轻摇混匀。48 h后,用同温去离子水冲洗一次,取2个发芽盒,标记水洗后,垫上3层用蒸馏水浸润的发芽纸,将种子均匀摆在发芽纸上,加蒸馏水至浸没。再另用滤纸加水浸湿,覆盖在发芽盒底部,发芽盒置于25培养箱中。恒温箱暗培养3 d,出芽后补光培养。大麦种子发芽:水稻种子播种7 d后进行大麦种子发芽。供试的XZ26种子用3% H2O2表面灭菌处理20 min,用去离子水冲洗4次后在发芽盒中发芽,播种方法同水稻种子。发芽盒放置在25的生长室中暗培养3 d,出芽后补光培养。3.2.2 苗期盐胁迫处理大麦发芽9天后,将水稻和大麦幼苗各自移栽到6个盛有营养液的6*8孔塑料黑箱(15 L)中进行水培,水稻、大麦各分为2个处理组与1个实验组。每处理(箱)各设置4 6 = 24个重复,每个重复取2粒发芽状况良好的种子在海绵固定下种1个孔。大麦的水培箱用气泵连续充气。所有处理在温室中培养,培养条件为光照14 h,黑暗10 h,昼夜温度设置为22/18,营养液pH控制在5.6左右。定期更换营养液,配方

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