分子诊断学第五章核酸扩增技术
61页1、第五章 核酸扩增技术,核酸扩增技术,Thermocycling based PCR (Polymerase Chain Reaction, Roche Diagnostics) Reverse Transcription-PCR (“RT-PCR“) Real-Time PCR Multiplex PCR Nested PCR On-Array-PCR Digital PCR LCR (Ligase Chain Reaction, Abbott Laboratories) -MLPA (Multiplex Ligation-dependent probe amplification) Isothermal techniques NASBA (Nucleic Acid Squence Based Amplification RCA (Rolling Circle Amplification) RPA (Recombinase Polymerase Amplification) SDA (Strand Displacement Amplification) LAMP (Loop-media
2、ted isothermal amplification) Signal Amplification bDNA (Branched DNA, BayerSiemens),第一节 聚合酶链反应,一、PCR的基本原理和反应过程 变性 Denaturing 退火 Annealing 延伸 Extension,Polymerase Chain Reaction (PCR),Example thermal cycler protocol Step 1 5 min at 94C Initial Denature Step 2 40 cycles of: 30 sec at 94C Denature 30 sec at 52C Anneal 1 min at 72C Extension Step 3 5 min at 72C Final Extension Step 4 Infinite hold at 4C Storage,二、PCR的反应体系和反应条件,(一)反应体系: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液 1. 模板(Template) 基因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体D
3、NA 模板DNA必须有较高的纯度 RNA作为模板,须先将RNA逆转为cDNA 常规PCR的模板DNA量一般仅需50-100ng左右 体系中较低量的模板有利于提高扩增的产量和减少 非特异性扩增。,(一)反应体系: 2.引物(Primer) 设计原则: 设在被扩增目的片段的双侧两端,并分别与模板正负链碱基序列互补。 长度以15至30个核苷酸为宜。 两条引物之间(尤其3-OH未端)的序列不能互补。 引物的碱基组成应平衡,避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。C+G 比例以45%-55%。引物3端尤其要避免重复的CG碱基序列。 PCR扩增的退火温度是根据引物的Tm值而决定的,两条引物的Tm值不能差别太大。 据需要可在5端加修饰成分或标记分子。 保证与其它靶序列无同源性;引物浓度一般为0.1-1M之间。,(一)反应体系: 3.Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase) 水栖噬热菌(thermus aquaticus)中提取,热稳定性高。 以DNA为模板,在引物3-OH端加上dNTP,在两者间形成3-5 磷酸二酯键,使DNA链沿53方向延伸。 Taq DNA 聚合酶缺乏35核酸外切酶活性
4、。在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000,碱基替换率为1/8000。 Pfu DNA聚合酶,Vent DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性,具有较高的保真性,可使碱基错配率降低。 50-100l 的PCR扩增体系一般需1-2.5U酶。,(一)反应体系: 4.脱氧核苷三磷酸(dNTP) dNTP 是dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP四种 脱氧核苷三磷酸的混合物。 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致。 dNTP浓度一般为20-200M。 降低dNTP的浓度可相应提高反应特异性。,(一)反应体系: 5.Mg2+浓度 Mg2+是Taq DNA polymerase 不可缺少的辅助因子,可稳定扩增体系,提高酶活性。 Mg2+浓度过低使酶活力降低,过高使酶催化非特异性扩增。 通过实验优化PCR扩增条件,寻找Mg2+最佳反应浓度。,(一)反应体系: 6.其他因素 酶缓冲液pH用1050mM Tris-HCl 调整至8.3 8.8。当温度上升至72,体系的pH约在7.2左右,使酶发挥最大酶促活性。 PCR缓冲液中KCl的浓度为50mM,缓冲液可加BSA、Tween 20、DTT等酶保护剂
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