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软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择

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1、软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。如何选择合适的转染试剂，一般可从以下几个方面考虑：一、对siRNA有较高的

2、转染效率。转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。金标准无疑是检测目标基因的mRNA水平，因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的siRNA释放出来，发挥抑制基因表达的作用。通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高。因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等，其中，Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌，RFect转染试剂虽在国内生产，但实际上是在美国研发成功，拥有国际发明专利。就转染效率而言，RFect与RNAiMAX对绝大多数贴壁细胞的基因抑制效率都比较高，RFect在A549细胞中对LaminA/C的基因抑制效率可达95%，RNAiMAX在A549细胞中对LaminA/C的基因抑制效率也能到

3、90%，与之相比，Lipo2000的抑制效率只有70%左右。显然，从转染效率上说，RFect与RNAiMAX更具优势。二、对待转染细胞的毒性很小。转染试剂如果毒性过大，会导致大量细胞死亡，这会直接影响对转染试验结果的判读和解析。脂质体类转染试剂本身会导致某些基因的表达改变，因而会影响转染试验结果的客观性。以上可见，应尽量选择毒性小的转染试剂。有些研究者对细胞毒性不太重视，仅仅考虑是否可将siRNA转染进入细胞，其结果在某些高水平的期刊，往往会导致审评的质疑。对于国内常见的几种转染试剂来说，RFect转染试剂主要由生物纳米材料制成，细胞毒性最低，细胞死亡率不到5%。RNAiMAX与Lipo2000属于脂质体类转染试剂，具有脂质体固有的细胞毒性，其中RNAiMAX的细胞死亡率在15%左右，Lipo2000的毒性较大，细胞死亡率在30%左右。三、转染细胞的种类。目前常见的转染试剂包括RFect、Lipo2000、RNAiMAX及国内其它厂家的产品，主要转染对象为贴壁培养细胞，对悬浮细胞和原代细胞的转染效率都不是非常理想。Lipo2000对原代和悬浮细胞基本上无法做到有效转染，而且因为原代细胞较驯化的细胞株敏感性更高，Lipo2000转染后的死亡率也很高。RNAiMAX在部分原代细胞中的转染效率可达60%，但细胞毒性也比较明显，我们实验室曾用之转染过血管内皮细胞，发现细胞成片死亡，导致实验无法继续。RFect转染试剂细胞毒性较低，但转染原代细胞和悬浮细胞的效果也不是非常理想，需要选择该系列专门的原代细胞和悬浮细胞转染试剂。另外，RFect转染试剂存在有比较明显的缺点，不能用于质粒DNA的细胞转染，如果既要转染siRNA,还要转染质粒DNA，需要另外选购质粒DNA转染试剂。

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