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[精品]实验三骨髓法制备小白鼠染色体标本24

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  • 卖家[上传人]:tian****1990
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    • 1、实验三 骨髓法制备小白鼠 染色体标本,第二部分 细胞遗传学,一、实验目的,1、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方 法及操作技术。 2、进一步观察了解畜禽染色体的形态学及 遗传学特征。,在骨髓细胞中,有丝分裂的指数是相当高的,通过注射秋水仙素使正在分裂的细胞停止在有丝分裂中期,再经过低渗、固定、滴片就可以获得大量的骨髓细胞染色体分裂相。,二、实验原理,1、研究染色体的材料,处于分裂旺盛期的组织: (1)动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸等。 (2)果蝇三龄幼虫的唾腺 (3)植物的根尖(如洋葱),2、研究染色体的方法,1、材料获取 直接获取细胞(骨髓、唾腺) 细胞培养(猪淋巴细胞培养法) 2、非切片法 滴片法细胞培养材料、骨髓 压片法果蝇唾腺,植物的根尖,三、实验材料、仪器和试剂,材料:小白鼠(2225g )。 仪器:显微镜、注射器、10ml离心管、吸管、 试管架、载玻片、恒温水浴锅、离心机、 剪刀、磁盘、镊子等。 试剂:秋水仙素、KCl、磷酸缓冲液、冰醋 酸、甲醇、Giemsa液等。,1、秋水仙素处理:取骨髓前23h,给小白鼠腹腔注射秋水仙素液(注射剂量为2g/g小白鼠体重),四、制备步骤

      2、,2、杀鼠取髓: 采用脱颈椎法处死小白鼠。用剪刀剪开后腿上的皮肤和肌肉,取出股骨,剔净皮肉,再用剪刀剪掉股骨两端,用注射器分两次吸取0.075MKCl溶液(共5ml)通过针头注入骨髓腔缓慢将细胞冲入离心管,反复冲洗直到骨髓腔发白为止。,注意事项:,注射器,剪掉,剪掉,3、低渗:将获得的骨髓悬液用吸管立即将细胞团吹散打匀,两组同时放入37恒温水浴锅内低渗30min。低渗结束时,向试管中加入加预固定液(甲醇:冰乙酸3:1,现配现用)810滴 ,混合均匀(以防细胞结团),平衡(注意2管同时离心)后1000r/min离心10min,弃上清。,4、第一次固定:在弃去上清液的试管中。 加入新配的3:1甲醇冰醋酸固定液56ml,用吸管轻轻吸打均匀,室温静置30min进行第一次固定。平衡后1000r / min离心10min,弃上清(可留0.5ml) 。 5第二次固定:在弃去上清液的试管中。加入新配的3:1甲醇-冰醋酸固定液56ml,用吸管轻轻吸打均匀,室温静置30min进行第二次固定。平衡后 1000r / min离心10min ,弃上清(留0.2ml左右) 。,6、滴片:在弃去上清液的试管中加入适

      3、量(210滴,在老师辅导下加)新配固定液,用吸管吹打均匀制成细胞悬液,滴23滴于冰冻的载玻片上,立即用嘴吹气使细胞迅速分散,在载玻片后面一角写上学号,空气干燥。 7、染色:将染色体制片细胞面朝下反扣于染色板上,用1:9Giemsa稀释液染色30min,小水流自来水冲洗浮色,空气干燥后,显微镜下观察。,小白鼠睾丸细胞分裂10倍物镜下,小白鼠的染色体分裂相(2n40),五、骨髓法需要注意的问题,1、秋水仙素的量一定要合适,太少分裂相少,太多染色体短粗。 2、为了节省时间,可直接用低渗液(约5ml)冲骨髓入离心管。 3、注意将两组离心管同时放入水浴锅中,由1人记录时间,同时进行预固定,然后离心。 4、低渗时间一定要严格时间,加预固定液8滴,混合均匀平衡离心(注意2人一组同时离心),低渗的作用?,目的是使低渗液在一定温度、一定时间内渗入细胞内,使细胞涨大,细胞膜变薄,在滴片时细胞才能破裂,染色体才能平铺在载玻片上。 实验证明小鼠和雏鸡都用37 2021分钟最好。,预固定的作用?,在低渗结束后,往细胞悬液中加入甲醇:冰醋酸(3:1)约1ml,可以使细胞表面轻微固定,以防止细胞结团。,固定的作用?,为了除去染色体中的蛋白质,使得染色体分散良好清晰可见,在实验中如果发现分散不够好,可采取延长固定时间或用甲醇:冰醋酸=3:1再固定一次可以改善染色体分散情况。,六、作业,1、 每个人完成一份实验报告,写明实验目的、原理、材料器具试剂、步骤、绘出你所做的染色体标本图形。 2、如失败,请分析失败的可能原因。 3、请对本次实验提出改进意见,并写出实验体会。,谢谢!,

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