宋存江《微生物发酵工程》第4章 微生物发酵过程

1、第四章 微生物发酵过程 (Microbial Fermentation-Process) 一. 微生物发酵的类型 二. 种子扩大培养 三. 发酵培养基 四. 发酵过程中间分析 五. 发酵终点的判断 六.主要技术经济指标,微生物发酵的不同类型,一. 微生物发酵的类型,如：黑曲霉发酵生产柠檬酸； 棒状杆菌的Glu发酵； 地衣芽胞杆菌发酵生产聚谷氨酸等,如：乳酸杆菌的乳酸发酵； 梭状芽孢杆菌的丙酮丁醉发酵等,空气,如，酵母厌氧产酒精；好氧积累菌体；,另外，细胞固定化，生物法处理废水，细菌采矿等等;,固定化细胞,Next page,Next page,发酵形式 优 点 缺 点 固体 投资少，设备简单，操作容易可因陋就简， 广房面积大劳动强度 发酵 因地制宜，利用农副产品以及下脚料作为 大不易机械化操作。 原料进行生产。 液体 液体环境适合菌体生长和物质传递，发酵在均 投资大，设备要求严格， 发酵 质条件下进行，便于控制，液体输送方便，易 动力消耗比较大 于机械化操作，产品易精制 设备占地少，容 量大，可自动控制，适合大规模生产。,固体发酵和液体发酵的区别,表面发酵和深层发酵 表面培养法 深层培

2、养法 放置曲盘需要更多的厂房 利用密闭的发酵罐 需要更多的劳动力 相反 利用抵押空气鼓风机 需要高压空气 动力消耗少 空压机、搅拌耗能 需要简单控制 需要精密控制 很少有污染问题 污染往往成为严重问题 产品回收包括水溶、抽提、 相同 过滤、离心、蒸发、沉淀 相同,发酵罐进行的间歇操作称为分批发酵。在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以调节发酵液的pH值，除此以外，与外界没有其它的物料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。分批发酵中菌体生长规律及生长参数的数学模型将在第七章已有详述。工艺变量随时间而变化是该发酵方式的主要特征。摇瓶培养也属分批发酵.分批发酵的主要设备是种子培养罐、主发酵罐、无菌供气系统和产物分离纯化系统。分批发酵的基本过程如图,1. 分批发酵 (Batch Fermentation),2. 补料分批发酵 (Fed-batch Fermentation ) 以某种方式定时向培养系统补加一定营养物质的发酵方式称为补料分批发酵。它是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。定时补料的同时并不向外排放发酵液，所以使发酵系统不再封闭，且培养液体积随时间和物料流

3、速而变化。由于营养底物缓慢补入，既满足微生物生长和产物合成的持续需要，又避免了由于底物基质过量所引起的各种调控反应。 定时补充物料，可使培养液中的底物浓度较长时间地保持在一定的范围内，既保证了微生物生长，又不会产生不利影响，从而达到提高容量产率、产物浓度和得率的目的。 补料技术可以采用少量多次、少次多量、流加或微机控制流加；整个发酵过程中不断地调节补料率，维持各项物质的供需平衡。 根据补入物料的组成可将补料分批发酵分为完全补料发酵和半分批补料发酵。完全补料发酵是补入成分完全的培养基。半分批补料发酵是仅补入一种或几种限制性营养成分。,3. 连续发酵 (Continuous Fermentation ) 连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。下图为典型的实验室连续发酵系统。,连续发酵的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。,4. 固态发酵 (Solid State Fermentat

4、ion ) 固态发酵是指微生物在没有游离水或几乎没有游离水的较湿的固态培养基上的发酵过程。固态的湿培养基一般根据成分不同控制含水量在40-80左右，无游离水流出。农村的堆肥、青饲料发酵和酿酒制曲，就是典型的固态发酵。特别是我国工艺历史悠久、国际著名的白酒生产都有自己独特的固态发酵工艺过程。由于固态发酵方式节能、环保，近来又得到了人们的青睐。如：以产朊假丝酵母（Candida utilis）、面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）和啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）为复合发酵菌种，以麸皮、大豆饼和少量脱毒棉籽饼为原料，经固态发酵法生产饲料蛋白添加剂得到快速发展。 伴随着发酵工程机械化、自动化、化工技术和设备的改进，在传统固态发酵的基础上发展到现在的固态发酵。,现代固态发酵和传统固态发酵的比较,固态发酵生物活性物质,固态发酵和液体发酵是微生物发酵的两大技术领域，各具特征，并存在着明显的区别。固态发酵投资少，设备简单，操作容易可因陋就简，因地制宜地利用农副产品以及下脚料作为原料进行生产。液体发酵适合菌体生长和物质传递，发酵在均质条件下进

5、行，便于控制，液体输送方便易于机械化操作，产品易精制同时，液体发酵设备占地少，容量大，可自动化控制，适合大规模生产，具有很大的优势。但是，如能解决好固态发酵的设备问题，固态发酵也将会发挥出更大的作用。,5. 高密度发酵 (High Cell Density Fermentation ) 微生物代谢产物的合成完全是靠菌体作为生产者来实现的。菌体量越多产物的产量也越大。因此，通过发酵工程实现高密度微生物细胞培养则是发酵的最终要求。 采用一定的工艺技术实现了高密度发酵，它不仅使发酵液的菌体浓度比分批发酵提高了10倍以上，而且使菌体的生产能力也处于最佳状态，并能消除有害代谢物对菌体正常发酵的影响。高密度发酵较分批发酵有显著的技术优势。表15-4 列举了几种微生物的高密度发酵结果。,菌 种 基础培养基 发酵罐 补料方法 细胞干重(g/L) 培养时间(h),大肠杆菌 葡萄糖矿物 搅拌罐 葡萄糖（甘油） 140-150 30-40 盐或甘油矿物盐 非限制指数补料 枯草杆菌 含葡萄糖的完全 搅拌罐 补料分批培养 185 30 培养基 补加葡萄糖调节pH 毕氏酵母 葡萄糖，矿物盐 搅拌罐 补料分批培养，

6、 100 50-120 补加甲醇,高细胞密度发酵成功的实例,高密度发酵生物反应器有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜反应器、气升式反应器、气旋式反应器等。日本人铃木等用搅拌陶瓷膜反应器系统实现乳酸杆菌高密度培养，其陶瓷过滤器可从发酵液中去除抑制生长的代谢副产物。日本人内野等采用内外两个圆筒的膜透析反应器，能连续去除抑制性代谢产物，始终保持菌体生长繁殖。 补料技术常用于高密度发酵，对提高菌体密度效果明显。有人采用三阶段式流加葡萄糖，高密度培养大肠杆菌重组菌株（YK537/pDH-B2m），菌体密度达到53 OD600，骨形成蛋白（BMP-2A）产量达到2.78g/L。但有些菌体高密度发酵菌体浓度较理论浓度尚有距离，仍需深入研究。,6. 基因工程菌的发酵 (Recombinant strain fermentation ) 分子生物学技术特别是重组DNA技术的快速发展，众多的基因工程产品相继问世。下表列举了部分基因工程菌发酵产生的药物及其用途。 工程菌常以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、某些假单胞菌、酵母菌、哺乳动物细胞等作为外源基因受体，其发酵培养与普通菌种的好气培养

7、没有本质的差异。基因工程菌通常采用二阶段发酵培养工艺，先在一定时间内提高菌体浓度，其后添加诱导物或改变培养温度而诱导外源基因的产物表达，并以综合评价决定产物表达的最佳诱导条件。 基因工程技术日臻成熟，所构建的工程菌已实现发酵生产，很多产品已投放市场。如：胰岛素、干扰素、生长激素、乙型肝炎疫苗、高产苏氨酸等。有的基因工程菌其产品产量已高于普通菌种。一种带有头孢菌素生物合成限制性扩环酶外源基因的工程菌，其头孢菌素C的产量比原有菌种提高了15%。,下表列举了部分基因工程菌发酵产生的药物及其用途,重组原核微生物生产的部分蛋白药物,1. 现代发酵技术的特点: (1) 发酵工程与化学工程更紧密的结合;(2) 发展酶，细胞的固定化技术。 (3) 遗传工程技术的应用，使得定向育种真正成为可能 (4) 计算机等自控技术的应用，提高了整体水平 2. 典型的发酵生产过程（见下页图）: (1) 原料的予处理: 淀粉质原料: a. 酸解: 原料(淀粉+水+HCL)-调浆-(加热)-糖化-冷却-中和, 脱色-过虑除菌-糖液。 b. 酶解: 原料(淀粉+水)-调浆-(加酶加热)-液化-降温-(加酶 加热)-糖化-糖

8、液 糖蜜类原料: a. 酵母生产: 浓糖蜜(40Be0)-稀释至17-18Be0-酸化(pH3.9)-水解(0.1MPa, 5min)-石灰乳调 pH(4.4-4.8)-静止24h-沉淀与上清-上清液中-加营养盐-灭菌 b. 柠檬酸发酵: 浓糖蜜(40Be0)-稀释1倍-加热(50-550C) -加浓H2SO4(1%)-加热(大于900C, 10 min) -澄清-沉淀- 取上清液-稀释至含糖11%-加NH4NO3(0.15%)-灭菌,二. 微生物发酵的一般过程,原料 原始菌种 预处理（粉碎，水解， 除杂） 斜面种子（活化）（一级种子） 配料 种子扩大培养（摇瓶或茄瓶）（二级种子） 灭菌 种子罐（一级发酵） 开放式、密闭式 发酵罐 （二级发酵 ） 半密闭式 控制发酵条件并进行 发醇过程检查 过滤，离心、蒸馏，萃取 产品提取 沉淀、离交，结晶、千燥 质量检查 成品 一般发酵工艺的全过程简图,典型的分批微生物反应工艺流程图,(2) 种子扩大培养: a. 固体发酵: 活化斜面-三角瓶-发酵原料 b. 好气性液体发酵: 活化斜面-摇瓶液体种子（或茄型瓶种子）-种子罐（1，2级)-发酵罐。 c. 厌气液体发酵: 静止培养法（以丙酮丁醇发酵为例） 活化斜面-不同水平三角瓶的逐级培养 (20mL-100mL-500mL)-6 L 卡氏瓶-200L卡氏罐-5000L发酵罐 (3) 基本操作方式: a. 分批操作(间歇操作): b. 半分批操作(流加法),反复半分批操作(反复流加法): c. 连续操作: (4) 产品的分离提取（后处理）: a. 酵母生产: 发酵液-连续离心-板框过虑-干燥 b. 味精生产: 发酵液-离子交换-浓缩-结晶-洗涤-重结晶-干燥-筛分 c. 酶制剂: 发酵液-喷雾干燥(粗品) d. 酒精与丙酮丁醇:

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