液相色谱实用技术色谱柱的使用及保养

1、液相色谱实用技术,色谱柱的使用及保养,良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽,色谱柱的使用及操作,流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱样品及溶剂的要求,色谱柱的保养（一）,样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用,色谱柱的保养（二）,流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例,在线的保护装置,给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染 装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱,在线过滤器,In-Line Filter，部件号 WAT084560 防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的

2、分析时中常用（如：氨基酸分析） 可更换的消耗品 更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs) 更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs),保护柱,可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 保护柱的种类 普通自装填料的保护柱 Waters的部件号，WAT084550，用户自装填料 影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大 Guard-Pak预装保护柱 Waters的部件号，WAT088141 有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积较小，也引起柱效降低,可换芯式保护柱,新型的保护柱 Sentry Guard,适应的用户类型 非常脏, 非常复杂的样品本底 生化样品, 溶液 环境样品 食品 不想作太多的固相萃取 不想降低柱效,新型的保护柱 Sentry Guard,Sentry Guard 的特点,特点 高质量, 高效填料 - 不损失柱效 增加分析柱效 - 增加适应范围 20mm柱长 - 脏样品载荷能力大，能延长保护柱寿命 手可拧紧接头，安装时不需要工具 通用柱套 - 适用于所有的HPLC柱(3.9及4.6内径) 整体式（对Waters柱）-

3、 使用方便，容易 各种不同填料配合Waters柱,Sentry Guard 的规格,产品描述 3.920mm柱长 适应任何色谱柱，不需工具即可安装及更换 可换柱芯式设计，提供各种填料: BondaPak: C18, phenyl, CN, NH2, Silica Nova-Pak: C18, C8, phenyl, CN, Silica Resolve: C18, C8, Silica Delta-Pak: C18, C4 Symmetry: C18, C8,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗,色谱柱的存放,存放前的处理 除去杂质、盐 合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干枯 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度,色谱柱常见毛病,柱压过高 多少才算高? 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低,柱压过高,为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流

4、动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长,柱效低,为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯,重复性差、回收率低,实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附,色谱柱以外的因素（一）,“柱效”问题，不一定是色谱柱问题！ 仪器问题：连接不好造成死体积 进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞 流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大,色谱柱与仪器的联接,除HP外，不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成： 色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏 解决办法： 自制相应的转换接头 使用“通用”型接头（锥箍及螺母） 这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的

5、。,Waters色谱柱的联接,Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为：“stop-depth” Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸 Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公司其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其 stop-depth 为0.090英寸,不同的Stop-Depth长度,色谱柱以外的因素（二）,柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题 阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱 压力传感器不准确 流速是否错误?,色谱柱以外的因素（三）,实验的重复性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法的开发不好 缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足,简单的判别方法,高的柱反压是否伴随着 保留时间变化? 峰形变坏? 分辨率变坏? 测量色谱系统的谱带展宽 典型的分析系统应远小于 100 微升 如大于

6、此数应检查仪器系统,测量色谱系统的谱带展宽,卸下色谱柱，用UNION代替之 按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约25微升 用5 sigma方法测4.4%峰高处的峰宽：W 仪器参数 流速1.0 ml/min 纸速20 cm/min (用记录仪时，接检测器10mV档) 检测器灵敏度0.5-1.0AUFS (用记录仪时) 检测器时间常数小于0.2 谱带展宽（ml） =1000W（cm）/20 （记录仪） =1000W（min） （工作站）,流动相及样品的预处理,液相色谱实用技术（二）,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相对的要求外，还有 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果

7、超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度,样品的预处理,样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤,样品预处理常用的方法,高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱 其他,样品预处理的过程,去除微粒,过滤 过滤膜/过滤装置 有机(0.5m)/无机(0.45m) 膜片可更换 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理 高速离心 大于：10,000g,超滤,机理 超滤是一种基于分子量分离的技术 目的 根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份 除去小分子样品中的大分子蛋白 脱盐,选择性沉淀,常用于生化

8、样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA,样品衍生,提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析,样品衍生氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,浓缩样品,浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱,固相萃取（SPE）技术,固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上 加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性,Waters的Sep-Pak小柱,Waters专门开发了固相萃取技术（SPE） Sep-Pak小柱的应用领域 除去杂质及干扰组份 把样品分成不同极性的组分析 富集微量的组份 Sep-Pak小柱的主要种类 反相 正相 离子交换,Sep-Pak的种类

9、,根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开 让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用 让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱,各种Sep-Pek小柱（一）,正相 包括Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina 可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液）平衡 加入样品 用非极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如NH2 / CN 确认回收率,各种Sep-Pek小柱（二）,反相 包括C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol / NH2 / CN 可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍 柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了 样品溶解在强一些极性的溶剂中 加入样品 用强极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 确认回收率,各种Sep-Pek小柱(三),离子交换 包括Accell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2 可先用6到10倍柱体积的去离子水或弱缓冲液平衡， 样品溶解在去离子水或弱缓冲液中 加入样品 用弱缓冲液洗脱不想要的组份 用强一些缓冲液（改变pH或离子强度）洗脱第一组感兴趣的组份 用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份 确认回收率,Sep-Pak小柱的方法开发,SPE方法开发的几个关键因素 文献查阅 Waters有专门Sep-Pak应用资料的数据库（P/N = 88286） 查阅Waters的网页（http:/） 流速控制 同色谱理论：以10ml/min润湿小柱，15ml/min加载样品 离子交换填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加载样品 以15ml/min流速洗脱样品 注意样品本底的不同 注意载荷量及加样方式,用Sep-Pak C18除去杂质,使极性的杂质先流出 中等极性样品流出，保留并分析 小柱及其非极性杂质丢弃 举例：多肽混合物脱盐 小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。 把样品载入小柱 盐等极

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