《分子杂交技术hu》ppt课件

1、第十章 分子杂交技术,分子杂交（molecular hybridization）是用一个DNA单链或RNA单链与另一被测DNA单链形成双链，以测定某特异顺序是否存在。,Basic Principle,Denature,Hybridize,Southern, Fish,PCR,Protein: Antigen-antibody interaction,DNA: denaturation and hybridization of the helix structure,第十章 分子杂交技术,第一节 分子杂交 第二节 核酸杂交简史与原理 第三节 核酸探针标记的方法 第四节 核酸分子杂交因素 第五节 几种常见的杂交 第六节 其他类型杂交介绍 第七节 原位杂交,第一节 分子杂交,1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） 1.2 斑点杂交（dot blotting） 1.4 Northern hybridization 1.5 Western blotting 1.6 电镜观察,1.1 原位分子杂交（in situ hybridization） 原位分子杂交有两种: 玻片

2、原位杂交 膜上原位杂交,玻片原位杂交 一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等; 片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱； 若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复盖上一张同样大小X光片进行放射自显影，然后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位置。 如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。,膜上分子杂交 将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），这种膜只吸附单链DNA。 将影印好的膜用NaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使DNA变性吸附在膜上； 然后用无关的单链DNA，如常用小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上，干挠实验结果。 膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。,1.2 斑点杂交（dot blotting） 也叫狭缝杂交。是由Southern blot衍生而来。方法是将某种生物的总DNA直接点滴在尼龙膜上，或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。 再将其和探针放入复性缓冲溶液

3、中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分析DNA样品之间的同源性。 此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一步做Southern blotting加以验证。,1.3 Southern blotting 该技术是Southern，E.M于1975年首先建立的，故称为Southern杂交，该方法经Southern印迹法将胶上的电泳条带吸印尼龙膜上，然后和DNA探针杂交。 用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片段长度的多态性，及动物园吸印（Zoo blot）（用一个物种的DNA探针和别种动物的DNA进行Southern blotting）等。,1.4 Northern hybridization Northern杂交的技术和Southern杂交相似，作者并不姓“Northern”，因“Southern”意为“南方”，故戏称自己的分析方法为“北方”“（Northern）杂交。 Northern 杂交与Southern杂交主要的不同之处在于检验RNA，而不是DNA。 首先是提取某种生物或组织的总RNA或mRNA，然

4、后用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNA，变性剂的作用是防止RNA自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。 电泳分离后再将凝胶上的RNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时空特异性。,1.5 Western blotting 既然有了“南方”杂交，“北方”杂交，那么随之而来的就是“西方”杂交（Western blotting），但Western blotting和前面的几种杂交都不相同，它是用来测蛋白而不是检测核酸。 此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质技术。,1.6 电镜观察 先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内含子的探测以及缺失的确定等。 断裂基因就是用这种方法发现的。 电镜观察有二种，一是异源双链定位法（Heferoduplex mapping），二是R-环定位法（R-loop mapping） 将异源DNA双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜下观察，可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。 R-环法是将标记的mRNA和变性后的待测双链DN

5、A进行杂交，制片后，可以观察到R-环，这是由于RNA形成的双链比原来的DNA双链更为稳定，将一条DNA单链置换了出来，表明该mRNA基因就位于R-环这个位置。,第二节 核酸杂交简史与原理,2.1 核酸杂交技术简史 2.2 核酸杂交原理,2.1 核酸杂交技术简史 1961年，Hall等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的研究。 1962年，Bolton等设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。 变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。 用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。 在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。, 上世纪60年代中期，Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。 如Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。RNA在代谢过程中被3H尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA杂交，继而用RNase处理，消化

6、非特异性结合的RNA。漂洗后计数以测定杂交探针的量。 通过计算与已知量DNA杂交的RNA量即可评估rRNA基因数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。,上世纪60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度， 从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液，经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。然后冷至约60，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。 该实验可比较不同来源生物DNA的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。,进入70年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如： 对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验的研究。 固相化的Poly U Sepharose和寡（dT）-纤维素使人们能从总RNA中分离Poly A+ RNA。 用mRNA的经纯化技术可从网织红细胞总RNA中制备-和-珠蛋

7、白mRNA混合物。这些珠蛋白mRNA首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。 由于制备cDNA探针很繁琐，所获得cDNA的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推广的基础。,70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展。 限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。 各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富。 人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNA探针。,由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18100个碱基的寡核苷酸探针。 应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因。 特异DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印迹和Northern印迹来测定，与以前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。,2.2 核酸杂交原理 分子杂交(简称杂交，hybridization)是核酸研究中一项最基本的实验技术。 应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的

8、DNA(或RNA)片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。,荧光原位杂交,2.2.1 制备样品 首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。 用限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。 将含有DNA片段的凝胶进行变性处理，转印到支持膜上并使其牢固结合。 RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。,2.2.2 制备探针 探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。 作为探针的已知DNA或RNA片段一般为3050核苷酸长，可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的mRNA。 在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。标记常用的为同位素标记法和生物素标记法。 通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。,2.2.3 杂交 杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。 应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品（如为双链，则

9、须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶液中标记探针进行杂交。 首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。 杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。,2.2.4 检测 检测的方法依标记探针的方法而异。 用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置； 用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。,第三节 核酸探针标记的方法,3.1 双链DNA探针及其标记方法 3.2 单链DNA探针 3.3 寡核苷酸探针 3.4 RNA探针,核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针； 根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针； 根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针； 根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。,3.1 双链DNA探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。 双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。,3.1.1 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli DNA聚合酶就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。 该酶同时具有从53的核酸外切酶活性，能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。,(2) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。 (3) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用仔细纯化后的DNA。,缺口平移标记示意图 影响因素: (1) 产物的比活性取决于-32PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。,3.1.2 随机引物合成法 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。 合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。优点： (1)K

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