肺炎链球菌分离与鉴定

1、肺炎链球菌的分离和鉴定,卫生部北京医院 陈东科,概 述,肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。,肺炎链球菌不产生外毒素，主要靠荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎和败血症等。,细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。,一、生物学性状,1. 形态与染色,肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。,2. 培养特点,（1） 培养基 肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5马血或羊血） 。 琼脂浓度可适当下降至11.2，有利于肺炎链球菌的生长。,（2）分离培养,1）标本处理 及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，

2、肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。,2）选择性分离培养基,培养基中添加5g/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。,3） 培养环境,510CO2、35培养2448h。,（3）肺炎链球菌的菌落形态,在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。,肺炎链球菌,肺炎链球菌,肺炎链球菌,3.抗原结构,（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。 （2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为、等个型，其中、型致病性最强。 （3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。,二、肺炎链球菌鉴定,肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。,肺 炎 链 球 菌 鉴 定

3、 要 点,革 兰 阳 性 双 球 菌， 矛 头 状， 不 呈 链； 血 平 皿 菌 落 呈 草 绿 溶 血， 湿 润， 菌 落 表 面 无 小 白 点； 培 养 时 间 长 出 现 脐 窝 状； 胆汁溶解试验阳性； 乳 胶 单 克 隆 抗 体 凝 集 阳 性。,口腔链球菌,1. 溶血性检查,肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。,2. Optochin(OP)敏感试验,optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。 optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5g/片的optochin纸片，置510%CO2的大气中（或烛缸），35孵育过夜。抑菌环直径=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径14mm时参照胆汁溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。,也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin

4、的抑菌环直径=14mm。应注意鉴别。 但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而缓症链球菌和口腔链球菌对OX耐药。这可作为辅助鉴别点。,肺炎链球菌,肺炎链球菌,3. 胆汁溶菌试验,自溶酶是一种L-丙氨酸-N-乙酰胞壁酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。 自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。,（1）试管法: 取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。,（2）平皿法: 加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。,胆溶阴性,4.乳胶凝集试验,结果准确、快速、特异性高。,5. 荚膜肿胀试验,取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美

5、蓝液混合后加盖片，室温1020min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。,6. 凝集试验,包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。,表1 非溶血链球菌的鉴别, 菌 种 Optochin 胆汁 胆 汁 6.5%NaCl 吡咯烷 卫星现象 CAMP 血清群 敏 感 溶菌 七叶苷 肉汤 酮 酶 肺炎链球菌 + + 牛链球菌 + D 无乳链球菌 d + B 草绿色链球菌 营养变异链球菌 + + *d.不同菌株,三、肺炎链球菌的药敏试验,K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂5羊血培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液，在15分钟内接种完)作为接种液。 稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和Etest法。 培养条件：为35 、5CO2培养2024小时。质控菌株ATCC 49619。,1.肺炎链球菌的耐药机制,青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是-内酰胺类抗生素的作用靶位，改变后使P

6、BP与青霉素G的结合力下降； 青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于1967年； 多重耐药肺炎链球菌（MDR）1977年首次在南非爆发流行。,肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致。,肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变，即核糖体50S亚单位改变所致，由ersB(erythromycin resistance methylase)基因介导，其耐药表型为MLS，即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。另一耐药机制为主动外排系统，由mefA基因介导，其耐药表型为M，即对14元环（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素）、15元环（阿奇霉素）大环内酯类低水平耐药，而对16元环大环内酯类（罗他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素）、林可霉素和链阳霉素B敏感。,耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径: (1)克隆传播，是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。 (2)基因水平转移，是把耐药基因转移到敏感菌株中。 过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在抗生素的压力选择下，敏感菌

7、株被杀死，耐药菌株确能生存下来, 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。 研究发现证实儿童鼻咽部存在“隐匿性耐药克隆株” 。 随着我国儿童-内酰胺类抗生素大量使用, 可以预计不久的将来, 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。,2.耐青霉素肺炎链球菌的检测,纸片扩散法对内酰胺类药物结果的准确性不够，用1g/片苯唑西林(OX)筛选肺炎链球菌对青霉素耐药时，当抑菌环直径小于20mm时，就必须做稀释法证实是耐药。,3.肺炎链球菌的药敏报告,用1ug/片苯唑西林纸片测试青霉素敏感性，当抑菌环20mm或MIC0.06ug/ml可报告青霉素敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。,肺炎链球菌的药敏报告（续1）,当苯唑西林抑菌圈19mm时应确定青霉素、头孢噻肟或头孢曲松的MICs，因为抑菌环19mm可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌株中。,肺炎链球菌的药敏报告（续2）,当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌，应常规报告MICs。测定的药物应包括青霉素、头孢噻肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。,4.肺炎链球菌感染的治疗,青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗; 青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进行治疗； 如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉素或利福平进行治疗。,总 结,1. 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是条件 致病菌； 2.肺炎链球菌对营养要求较高，在含有新鲜血液 的培养基中生长良好； 3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌 与其他溶血链球菌相区别； 4. 血清学鉴定特异性高； 5. 要注意对PRP和MDR的检测。,谢谢！,

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