微生物基因工程-生物科学与技术学院

1、微生物基因工程,生物科学与技术学院,参考资料,吴乃虎,基因工程原理（上下），科学出版社，2002 陈守文 喻子牛, 生物生物技术-应用微生物学基础原理，科学出版社 2002年1月 张惠展,基因工程概论，华东理工大学出版社 童海宝,生物化工，化学工业出版社，2008年第2版,1 概述,1.1 发展概况 1.2 微生物与基因工程的关系 1.3 研究的主要内容 1.4 发展前景,微生物学,在分子、细胞或群体水平上研究各类微小生物,单细胞藻类,细菌 放线菌 真菌,病毒 立克次氏体支原体 衣原体,螺旋体原生动物,形态结构、生长繁殖、生理代谢、遗传变异、生态分布、分类进化等生命活动的基本规律,应用于工业发酵、医学卫生和生物工程,对象,内容,目的,发展概况,经验阶段,中国：制曲、酿酒、制酱、造醋和腌菜，沤粪积肥，白僵蚕治病、麦曲治腹泻、种痘等。 古希腊留下来的石刻上记有酿酒的操作过程; 1796年，英国人E琴纳发明了牛痘苗，为免疫学的发展奠定了基石。,形态学阶段,17世纪，列文虎克用文字和图画记载“微小动物”细菌的不同形态。意大利植物学家米凯利用简单的显微镜观察了真菌的形态。 1838年，德国动物学

2、家埃伦贝格在纤毛虫是真正的有机体中，创用细菌一词。 1854年，德国植物学家科恩发现杆状细菌的芽孢，将细菌归属于植物界，确定了此后百年间细菌的分类地位。,生理,生物化学及分子生物学阶段,生理学阶段,微生物操作技术和研究方法的创立是微生物学在这一阶段发展的特有标志。,19世纪60年代开始进入生理学阶段,法国科学家巴斯德对微生物生理学的研究为现代微生物学奠定了基础。,论证酒和醋的酿造以及一些物质的腐败都是由一定种类的微生物引起的发酵过程，并不是发酵或腐败产生微生物；,提出了防止酒变质的加热灭菌法，后来被人称为巴斯德灭菌法，使用这一方法可使新生产的葡萄酒和啤酒长期保存,研究人、禽、畜的传染病(狂犬病、炭疽病和霍乱等)，创立了病原微生物是传染病因的正确理论，应用菌苗接种预防传染病的方法,他的学生陆续发现白喉，肺炎、破伤风、鼠疫等的病原细；,德国微生物学家科赫 对新兴的医学微生物学作出了巨大贡献,首先论证炭疽杆菌是炭疽病的病原菌,接着又发现结核病和霍乱病原细菌，并提倡采用消毒和杀菌方法，防止这些疾病的传播；,首创细菌染色法，以琼脂作凝固培养基培养细菌和分离单苗落，获得纯培养操作过程；,规定了鉴定

3、病原细菌的方法和步骤，提出著名的科赫法则。,一种病原微生物必然存在於患病动物体内,但不应出现在健康动物内； 此病原微生物可从患病动物分离得到纯培养物； 将分离出的纯培养物人工接种敏感动物时，必定出现该疾病所特有的症状； 从人工接种的动物可以再次分离出性状与原有病原微生物相同的纯培养物。,-1860年，英国外科医生利斯特应用药物杀菌，并创立了无菌的外科手术操作方法。,1901年，著名细菌学家和动物学家梅契尼科夫发现白细胞吞噬细菌的作用，对免疫学的发展作出了贡献。,1892年，俄国植物生理学家伊万诺夫斯基发现烟草花叶病原体是比细菌还小的、能通过细菌过滤器的，光学显微镜不能窥测的生物，称之为过滤性病毒。,俄国出生的法国微生物学家维诺格拉茨基于1887年发现硫磺细菌，1890年发现硝化细菌，他论证了土壤中硫化作用和硝化作用的微生物学过程以及这些细菌的化能营养特性 ；,19151917年，特沃特和埃雷尔观察细菌苗落上出现噬菌斑以及培养液中的溶菌现象，发现了细菌病毒噬菌体。病毒的发现使人们对生物的概念从细胞形态扩大到了非细胞形态。,生物化学阶段,1897年德国学者E毕希纳发现酵母菌无细胞提取液与酵

4、母一样具有发酵糖液产生乙醇的作用，将微生物生命活动与酶化学结合起来；,G诺伊贝格等人对酵母菌生理和对酒精发酵中间产物进行了分析；,AJ克勒伊沃对微生物代谢进行研究，开拓比较生物化学的研究方向；,20世纪30年代起，人们利用微生物进行乙醇、丙酮、丁醇、甘油、各种有机酸、氨基酸、蛋白质、油脂等的工业化生产。,1929年，A弗莱明发现点青霉菌能抑制葡萄球菌的生长，揭示了微生物间的拮抗关系并发现了青霉素。,1949年，SA瓦克斯曼研究土壤微生物，发现了链霉素。此后陆续发现的新抗生素,抗生素除医用外，也应用于防治动植物的病害和食品保藏.,分子生物学阶段,1941年，比德尔和塔特姆用X射线和紫外线照射链孢霉，使其产生变异，获得营养缺陷型，为分子遗传学打下了基础。,1944年，埃弗里第一次证实了引起肺炎球菌形成荚膜遗传性状转化的物质是脱氧核糖核酸(DNA)。,1953年，沃森和克里克提出了DNA分子的双螺旋结构模型和核酸半保留复制学说。,近年来，原核微生物基因重组的研究不断获得进展，现代微生物学的研究将继续向分子水平深入，向生产的深度和广度发展,1957年，科恩伯格等成功地进行了DNA的体外组合和操

5、纵。,富兰克尔-康拉特等通过烟草花叶病毒重组试验，证明核糖核酸(RNA)是遗传信息的载体，为奠定分子生物学基础起了重要作用。随后相继发现转运核糖核酸(tRNA)的作用机制、基因三联密码、病毒的细微结构和感染增殖过程、生物固氮机制等微生物学中的重要理论。,微生物作用,在自然界物质循环中作用 空气与水净化，污水处理 工农业生产：菌体，代谢产物，代谢活动 对生命科学的贡献,1.2 微生物与基因工程,基因工程的基本过程： 目的基因的获得重组载体的构建重组载体导入宿主细胞阳性重组子的筛选基因的测序和鉴定基因的控制表达。,微生物参与基因工程的每个环节,微生物的多样性提供基因来源； 基因工程的克隆载体由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成； 基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得； 原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母是基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主。,动植物基因工程穿梭载体构建在大肠杆菌中完成外源基因或重组体DNA的拼接和改造。 大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是采用重组细胞通过微生物发酵罐的方式大量生产目的蛋白。,基因工程推动了微生

6、物学的发展,基因工程应用于基因工程药物、基因治疗、改造传统工业发酵菌种、动植物基因工程改良及环境保护中各个方面，促进微生物学的发展,应用于新的微生物资源的开发，认识和了解微生物世界中更多的微生物种类、微生物代谢、微生物遗传等将产生积极的影响。,研究的主要内容,微生物基因的应用前景,基因工程与医药卫生 基因工程与农牧业、食品工业 基因工程与环境保护,微生物基因工程与医药卫生,基因工程药品的生产,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。 如基因工程胰岛素、基因工程干扰素、人造血液/白细胞介素、乙肝疫苗。,“DNA探针”快速检测肝炎病毒 给遗传病患者导入正常基因。,基因诊断与基因治疗,基因工程与农牧业、食品工业,培育新特动植物品种，如生长快，耐逆境、肉质好的转基因鱼（中国），乳汁中含有人生长激素的转基因牛（阿根廷），抗青枯病甜椒、转鱼基因抗寒番茄等。,基因工程与环境保护,DNA探针查测环境中的病毒和细菌污染； 基因工程“超级细菌”分解和吞食环境有害物质。,2 微生物的遗传物质,2.1.证明遗传物质是DNA(有时是RNA)的三个经典实验 2.2 DNA的结构和复制 2.3.原核生物的染

7、色体和复制 2.4.真核生物的染色体和复制 2.5.基因结构和基因组,2.1证实遗传物质是DNA的经典实验,2.1.1细菌的转化 2.1.2噬菌体感染实验 2.1.3病毒重建实验,Figure 2.1.1 转化的本质是 DNA.,2.1.1 DNA 是遗传物质,细菌转化实验： 在转化作用中参入到接受体细菌细胞 的那段提纯的DNA。 首先在肺炎球菌 （pneumococcustype）的转化作用中 被发现，亦称transforming factor。,Figure 2.1.2 The genetic material of phage T2 is DNA.,2.1.2 DNA is the genetic material,病毒噬菌体T2能够感染大肠杆菌。当把噬菌体微粒加入大肠杆菌中后，它们吸附在大肠杆菌的表面，把其体内的部分物质注入到大肠杆菌内部，大约20分钟后大肠杆菌就会破裂，释放出大量的子代噬菌体的颗粒,Figurer right:Eukaryotic cells can acquire a new phenotype as the result of transfection b

8、y added DNA.,1.2 DNA is the genetic material,当DNA加入到某种在培养基中培养的真核单细胞生物群落中，核酸就会进入到细胞中去，其中有一部分就会合成出一些新的蛋白质。右图表示的就是一个标准实验。,2 .2 DNA的结构和复制,DNA的结构,DNA 双螺旋结构,多核苷酸链反向平行排列,RNA结构,RNA种类,原核生物与真核细胞的染色体,原核原核,真核细胞,DNA的复制,真核生物DNA复制,原核生物DNA复制,DNA复制的过程,复制的引发,DNA链的延伸,DNA复制的终止,包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3-OH末端复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成,DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶的作用。当冈崎 片段形成后，DNA聚合酶通过其53外切酶活性切除 冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为 引物由53合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶 将其接起来，形成完整的DNA滞后链。,在DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复 终止位

9、点处终止不一定等全部DNA合成完毕。目前对 制终止位点的结构和功能了解少,DNA复制,2.4 基因结构和基因组 +*-,基因 (gene) 合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。 一般是DNA序列（或RNA病毒中的RNA）。 具有编码一定生物功能分子的核苷酸序列,2.4.1 基因与基因结构,一个典型的真核基因包括： 编码序列：外显子(exon) 插入外显子之间的非编码序列-内合子(intron) 5-端和3-端非翻译区(UTR) 调控序列(可位于上述三种序列中),2.4.2基因组(genome),是指一种生物体中的整套(单倍体)遗传信息，如一个受精卵或一个体细胞的细胞核中所有DNA分子的总和。 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值 (C-Value)。,原核生物基因组,细菌染色体基因组：通常仅由一条环状双链DNA分子组成 1细菌DNA大部分为编码序列。 2结构基因中没有内含子，也无重叠现象。 3具有操纵子结构。 质粒：某些细菌中独立于染色体外的能自主复制的共价环状双链DNA。,细菌基因组的特点,原核生物基因组,1每种病毒核酸只有一种，或者DNA，或者RNA； 2病毒核酸大小差别很大，3 kb300kb； 3大部分病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成 4具有操纵子的结构，具有重叠基因的结构 5真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子 6除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。,病毒基因组的特点,大肠杆菌基因组,基因组约4.6M bp,不同菌株的基因组大小有细微的差别。 基因组中，绝大多数基因都以操纵子（operon）方式组合成表达单位。总共有600个操纵子，每个含2个或更多的顺反子。 操纵子含有一组彼此邻接的结构基因，基因间隔仅1至2个核苷酸。乳糖操纵子（lactose operon）是大肠杆菌中最具代表的例子之一，它含有3个涉及乳糖分解的基因。 乳糖不是大肠杆菌生存环境中通常遇到的营养成分，只有在乳糖作为唯一碳源时，乳糖操纵子才打开。,大肠杆菌基因密码子的使用频率和

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