第二章土壤微生物(南京农业大学)

1、第二章 土壤微生物学,第一节、土壤是微生物的大本营,土壤圈是地球系统的组成部分，它处于大气圈、岩石圈、水圈和生物圈的界面，同其它生物圈交互作用，是具有生命活动的体系和微生物生活的良好环境。 微生物既是土壤形成过程的作用者，又是土壤的重要组成部分。 土壤中微生物种类繁多、数量巨大，这是其他它任何生态系统不可相比的。,为什么土壤中存在如此众多的微生物？,1、土壤为微生物提供了良好C,N营养。 微生物生长需要最多的就是C，其次是N 植物的根系分泌物 30-40%的光合产物以分泌物的形式释放到土壤 脱落的根毛、表皮组织 植物的枯枝落叶 植物死亡后的残体 农业生产中施肥,2、土壤为微生物提供无机盐、微量元素,土壤本身含有各种无机盐，微量元素 农业生产中的施肥，P,K肥等，微肥等,土壤具有保水性，而且微生物比植物对水分的要求低，植物能生长的土壤，其水分肯定能满足微生物的要求,3、土壤满足了微生物对水分的要求,4、土壤p值范围5.58.5之间，能满足大多数微生物的要求。 而且微生物的适应性广,5、土壤中温度变化小昼夜，季节性变化小 （相对于大气、水体而言）,6、土壤是不均匀介质，土壤颗粒空隙间充满着

2、空气-好气微生物；颗粒内部厌氧-厌氧微生物,8、土壤能保护微生物不受烈日的曝晒，从而可使微生物免受各种射线的伤害,7、适宜的渗透压。,第二节 土壤中微生物的分布,一、微生物的分布 1、土壤的剖面结构与微生物的垂直分布 土壤剖面可以划分为O层、A层、B层和C层。 O层为有机质层，耕作土壤没有明显O层，除非在秸秆盖田的情况下；许多森林土壤中O层即为枯枝落叶层。 A层为淋溶层，它是土表以矿物质为主的一个层次，降水和灌溉造成强烈淋溶作用。 B层为淀积层，由上面层次淋洗下来的物质在此大量沉积。A层和B层加在一起称为土体层 C层可能有钙、镁碳酸盐的累积。 最下面为R层，即疏松母质层或基岩，,因土壤类型不同，层次结构及各层厚度可以有很大差异,表层土中（2030cm）含量最高，越往下，总的微生物数量越 少，但厌氧微生物数量下层土壤中多 地表土受阳光直接照射，其中微生物含量较低。但藻类在表层。 采取土样时一般要刮开表土23cm后采样。,2、植物根际土壤与微生物分布 植物根际土壤的微生物数量高于根外土壤 根际土壤 离根5mm以内的土壤rhizosphere soil 根际微生物rhizobacteria

3、根/土比（R /S)： 根际微生物数量和根外微生物数量之比 通常为几到几十 为什么？,根际微生物： 从根冠到成熟区根际微生物的数量快速增加； 需要碳水化合物有机酸和糖类较多的微生物大多繁殖于禾本科植物的根区，而要求氨基酸较多的微生物则繁殖于豆科植物的根区 根际微生物特点：数量多于根外土壤 ，但多样性小于根外土壤,根表的微生物分布是不均匀的，微菌落形式存在，根尖数量少，很多存在于根的裂隙中,3、根表的微生物分布,Scanning electron micrograph of a microcolony of Pseudomonas fluorescens strain WCS365 on tomato root,Confocal scanning microscopy analysis of tomato root colonization by P. fluorescens WCS365 expressing autofluorescent proteins. A mixture of two WCS365 derivatives expressing either cyan fluo

4、rescent protein (red cells) or yellow fluorescent protein (green cells) is shown; the overlap of the red and green colours results in yellow.,A mixture of three WCS365 derivatives,主要存在于裂隙,3、土壤团聚体与微生物的分布,土壤包含矿物质、有机质和各种生物，它们相互结合和作用使土壤具有结构性，特别是土壤团聚体(团粒)，它是土壤肥沃的重要因素 土壤矿物质颗粒按大小分为砂粒、粉粒和粘粒。 粘粒是直径小0.2 um的矿质颗粒，大的矿质颗粒为粉粒和砂粒。 粘粒的理化性质最活泼，同微生物的关系也最密切。,土壤中粘粒的某些特性,团聚体的微孔与结构,土壤团聚体之间和内部的气体与水分状况的差别也很大，而且是处于变动状态。 土壤空隙可以完全充满水分或气体，或两者兼而有之，影响微生物不同类群活跃程度。 由于土壤的结构性，即使在通气较好的表土层中也存在缺氧部位。,土壤团聚体内外CO2，O2浓度差别很大。 土壤气体中CO2的浓度一

5、般比大气中含量高 13个数量级。CO2和O2的浓度的变化受气体 扩散和微生物呼吸作用的影响。当土壤缺氧 时，不但CO2浓度增高，而且N2O、N 2、CH4 和H2S等还原性气体含量也增加。,土壤团聚体内外氧气的分布 （a)图示一个耕地粉砂壤土团聚体氧气浓度随距表面距离的延伸而迅速降低，至中央部位为一厌氧带； (b)等氧压线 图示耕地土壤的一个团聚体，在近中心部位为一厌氧带，由此向外氧气浓度逐渐升高，数字示O2 %。,团聚体表面的主要是好氧的微生物，而且微生物之 间竞争较激烈，数量和组成常有变化。 生活在团聚体内部的微生物主要是厌氧的微生物，而 且数量和组成相当稳定。 以微菌落形式存在。,二、 土壤的异质性与微生物分布的不均匀性和动态变化,由矿物质、有机质和微生物等固相及气相和液相组成的土壤，是地球上异质性极明显的自然体，不但具有层次性差异和复杂的内部结构，即使在同一层次的不同团聚休内外微生物的分布也有很大差异，造成微生物在土壤中分布的不均匀性。,耕作影响下土壤的异质性尤为显著,施入的有机和无机肥料即使充分耕翻也不可能是均匀地分布在土层的各个部位； 灌溉和施用农药等农业技术措施也加剧了土

6、壤的异质性。 所以，取土壤样品是非常关键的，多点取样,三、土壤微生物的季节性变化,春末微生物数量开始上升，到夏季达到最高，到秋天开始又下降，冬季的微生物数量最少。 原因： 一是温度，微生物的生长需要合适的温度，低温不利于微生物生长繁殖 二是营养，春末开始，植物开始生长，到了夏季，各种植物生长最为旺盛，根的分泌物增多，促进微生物的生长,第三节 土壤中微生物的数量及其活性,微生物数量决定于土壤的特性，各种土壤都有一定的载菌量和菌容量，它决定于土壤环境的理化因素 微生物数量的增减受各种外界因素的影响。 营养：当大量营养物质(如新鲜有机质)进入土壤时，异养型微生物的数量急剧增加，但养料消耗后数量会下降。土壤中某种微生物可以在数量上占优势或暂时具有较多数量，但不可能持续。 土壤温度：,微生物之间是相互制约的 当某一类群微生物数量剧增时，其它类群微生物的发展可能受到限制，甚至数量减少。 微生物数量可以用细胞数量来表示，也可以用生物量来表示。,一、土壤微生物的数量,细菌（bacteria） ：107-9/g土 放线菌（actinomyces） ：106-7/g土 真菌(fungi)： 103-4/g

7、土 藻类(algae):万个克土 原生动物(protozoon ):万个克土 数量：细菌放线菌真菌藻类原生动物 若按生物量计算则真菌的生物量最大。,上述微生物数量是可培养微生物的数量 土壤中的微生物绝大多数是不可培养的（95%） 不可培养微生物（uncultured microorganisms）,土壤中微生物的含量与土壤性状直接相关。 有机质含量高的土壤微生物数量高, 反之则少。 中性土壤微生物数量多 酸性土壤、碱性土壤微生物数量少 干旱土壤微生物数量少 耕作土壤比撂荒土壤中微生物数量多（为什么？）,不同类型土壤中微生物的数量,不同土壤类型、肥力水平，土壤微生物的数量和分布有很大差异。,一般来说，我国不同土壤微生物总数，呈如下变化趋势：,黑钙土 棕壤 灰壤 水稻土 砖红壤,二、微生物个体数量的测定,1、 平板培养计数法 制备土壤悬液，进行系列稀释后，涂布 在合适的培养基上培养,2. 最大或然数(most probable number，MPN)计数（稀释培养计数）,适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。 其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性

8、来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。 如氨化菌、硝化菌、纤维素分解菌、硫化和反硫化细菌等,测定原理和步骤,原理：MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到稀释液中没有或极少几个。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，计算出样品单位体积中细菌数。 步骤：菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取35次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。,如某一细菌在稀释法中的生长情况如下； 稀释度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 重复数 5 5 5 5 5 5 出现生长的管数 5 5 5 4 1 0 根据以上结果，在接种10-310-5的试管中，5个重 复都有生长；在接种10-6稀释液的试管中有4个重复 生长；在接种10-7稀释液的试管中有1个重复生长； 而 10-8稀释液的试管中没有生长。由此得出其数量

9、 指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘 以第一位数的稀释倍数（10-5 的稀释倍数为105 ）。 1ml原菌液中的活菌数 17 105 。,基于培养的计数法的缺点,第一，没有一种培养基和培养条件能够把土 壤中多种多样的微生物都同时培养出来，而 分类培养是很繁琐的，何况90以上的土壤 微生物尚不知道如何培养。 如用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定土壤 细菌的总数并不很适合，因为土壤中的微生 物大多是贫营养的。,温度的影响 一般实验室在分离、培养土壤细菌时通常只是在28-30 下培养。 但土壤中存在高温型细菌和低温细菌，但都被忽视了。其实在寒温带和温带地区土壤中也存在低温型甚至嗜冷细菌。 pH的影响 一般细菌培养基的pH为7.0左右。 显然细菌中存在着嗜酸或嗜碱的种群,日本学者从日本土壤中分离到许多生长于pH10和和0下的细菌，从约1000个土样分离的菌株中经纯化后有83株于0下在含1Na2CO3的固体培养基上生长，其中仅50株能在液体培养基中生长。 在加拿大土壤中也于低温条件下分离别油菜促生细菌。 华中农业大学研究者在28和10下分离到的小麦根圈细菌的类型有差别。,第二，不可能在制备土壤悬液时把土壤中的 微生物都清洗下来，所以获得的结果大大低 于实际数量,第三，能够洗脱出来的微生物也不是所有细 胞都能在培养基上生长和繁殖，有些细胞可 以转变为不可培养的状态,第四，微生物的个体数量对于细菌而言，一 个细胞就是一个独立个体，而对丝状微生物 如霉菌来说，测定结果就难以说明问题，因 为一条长菌丝可以形成一个菌落，它断裂为 一些片段后可以分别形成许多菌落，使不同 样本之间缺乏可比性。,3. 显微境下直接测数法,快速 粗放 不能区分活细胞和死细胞或者微小土壤颗粒， 超微细菌和粘粒即使在电镜下也难以区别，所以细胞总数的测定是很粗放的,3. 荧光定量PCR技术,提取土壤的总DNA 测定细菌的16S rRNA基因拷贝数 测定真菌的18S rRNA基因拷贝数 结果表示： 16S（ 18S） rRNA基因拷贝数/g土壤 误差来自： DNA的提取效率 PCR扩增,三、微生物生物量测

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