高通量测序基础知识

1、高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统 Sanger 测序（称为一代测序 技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称 其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测 序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序 (Deep sequencing)。 什么是 Sanger 法测序（一代测序） Sanger 法测序利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链 终止核苷酸为止。 每一次序列测定由一套四个单独的反应构成， 每个反应含有所有四种脱氧 核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP 缺 乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、A、T 或 C 处终止。终止点 由反应中相应的双脱氧而定。每一种 dNTPs 和 ddNTPs 的相对浓度可以

2、调整，使反应得到一 组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上， 可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用 X-光胶片放射自显影 或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序， 并在个体或群体水平上进行差 异性分析的方法。 随着基因组测序成本的不断降低， 人类疾病的致病突变研究由外显子区域 扩大到全基因组范围。 通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、 双末端测序相结合的策 略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变 位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是 de novo 测序 de novo 测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序， 利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个 物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。 随着新一代测序技术的飞速发展， 基 因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，

3、大规模基因组测序渐入佳境， 基因组学 研究也迎来新的发展契机和革命性突破。 利用新一代高通量、 高效率测序技术以及强大的生 物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量 测序的基因组分析方法。 外显子测序相对于基因组重测序成本较低， 对研究已知基因的 SNP、 Indel 等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。 什么是 mRNA 测序 （RNA-seq） 转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能 状态下所能转录出来的所有 RNA（包括 mRNA 和非编码 RNA）的类型与拷贝数。Illumina 提 供的 mRNA 测序技术可在整个 mRNA 领域进行各种相关研究和新的发现。 mRNA 测序不对引 物或探针进行设计， 可自由提供关于转录的客观和权威信息。 研究人员仅需要一次试验即可 快速生成完整的 poly-A 尾的 RNA 完整序列信息

4、，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全 新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样品 制备和数据分析软件支持在所有物种中的 mRNA 测序研究。 什么是 small RNA 测序 Small RNA（micro RNAs、siRNAs 和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、 生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina 能够对细胞或者 组织中的全部 Small RNA 进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将 18-30 nt 范围的 Small RNA 从总 RNA 中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成 cDNA 再做进一 步处理后，利用测序仪对 DNA 片段进行单向末端直接测序。通过 Illumina 对 Small RNA 大规 模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的 miRNA 图谱，实现包括新 miRNA 分子的挖 掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs 聚类和表达谱分析等科学 应用。 什么是 miRNA 测序 成熟的 microRNA（mi

5、RNA）是 1724nt 的单链非编码 RNA 分子，通过与 mRNA 相互作用影 响目标 mRNA 的稳定性及翻译，最终诱导基因沉默，调控着基因表达、细胞生长、发育等 生物学过程。基于第二代测序技术的 microRNA 测序，可以一次性获得数百万条 microRNA 序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的 microRNA 及其表达差异，为研究 microRNA 对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。 什么是 Chip-seq 染色质免疫共沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研 究体内蛋白质与 DNA 相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修 饰位点的研究。将 ChIP 与第二代测序技术相结合的 ChIP-Seq 技术，能够高效地在全基因组 范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段。 ChIP-Seq 的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的 DNA 片段进行

6、高通量测序。研 究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上， 从而获得全基因组范围内与组 蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段信息。 什么是 CHIRP-Seq CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白的高 通量测序方法。方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，把目标 RNA 拉下来以后，与其 共同作用的 DNA 染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通量测序，这样会 得到该 RNA 能够结合到在基因组的哪些区域，但由于蛋白测序技术不够成熟，无法知道与 该 RNA 结合的蛋白。 什么是 RIP-seq RNA Immunoprecipitation 是研究细胞内 RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网 络动态过程的有力工具，能帮助我们发现 miRNA 的调节靶点。这种技术运用针对目标蛋白 的抗体把相应的 RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的 RNA 进行测序分析。 RIP 可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀 ChIP 技术的类似

7、应用，但由于研究对象是 RNA- 蛋白复合物而不是 DNA-蛋白复合物，RIP 实验的优化条件与 ChIP 实验不太相同（如复合物 不需要固定，RIP 反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有 RNA 酶，抗体需经 RIP 实验验证等 等） 。RIP 技术下游结合 microarray 技术被称为 RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及 其它疾病整体水平的 RNA 变化。 什么是 CLIP-seq CLIP-seq, 又 称 为HITS-CLIP ， 即 紫 外 交 联 免 疫 沉 淀 结 合 高 通 量 测 序 (crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一项在全基因组水平揭 示 RNA 分子与 RNA 结合蛋白相互作用的革命性技术。其主要原理是基于 RNA 分子与 RNA 结合蛋白在紫外照射下发生耦联，以 RNA 结合蛋白的特异性抗体将 RNA-蛋白质复合体沉淀 之后，回收其中的 RNA 片段，经添加接头、RT-PCR 等步骤，对这些分子进行高通量测序， 再经生物信息学的分析和处理、总结，

8、挖掘出其特定规律，从而深入揭示 RNA 结合蛋白与 RNA 分子的调控作用及其对生命的意义。 什么是 metagenomic（宏基因组） ： Magenomics 研究的对象是整个微生物群落。相对于传统单个细菌研究来说，它具有众多优 势，其中很重要的两点：(1)微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它们的很多特 性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的，因此做 Metagenomics 研究比做单个个体的 研究更能发现其特性；(2) Metagenomics 研究无需分离单个细菌，可以研究那些不能被实验 室分离培养的微生物。 宏基因组是基因组学一个新兴的科学研究方向。宏基因组学（又称元基因组学，环境基 因组学，生态基因组学等） ，是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质的学科。传统 的微生物研究依赖于实验室培养， 元基因组的兴起填补了无法在传统实验室中培养的微生物 研究的空白。过去几年中，DNA 测序技术的进步以及测序通量和分析方法的改进使得人们 得以一窥这一未知的基因组科学领域。 什么是 SNP、SNV（单核苷酸位点变异） 单核苷酸多态性 singlenucleotide po

9、lymorphism，SNP 或单核苷酸位点变异 SNV。个体间基因 组 DNA 序列同一位置单个核苷酸变异(替代、插入或缺失)所引起的多态性。不同物种、个体 基因组 DNA 序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。有这种差别的基因座、DNA 序 列等可作为基因组作图的标志。人基因组上平均约每 1000 个核苷酸即可能出现 1 个单核苷 酸多态性的变化，其中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关，但可能大多数与疾病无关。单 核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。 在研究癌症基因组变异时， 相对于正常组织，癌症中特异的单核苷酸变异是一种体细胞突变（somatic mutation） ，称做 SNV。 什么是 INDEL (基因组小片段插入） 基因组上小片段（50bp）的插入或缺失，形同 SNP/SNV。 什么是 copy number variation （CNV） ：基因组拷贝数变异 基因组拷贝数变异是基因组变异的一种形式，通常使基因组中大片段的 DNA 形成非正常的 拷贝数量。例如人类正常染色体拷贝数是 2，有些染色体区域拷贝数变成 1 或 3，这样，该 区域发生拷贝数缺失或增加， 位于该区域内的基因表达量也会受到影响。 如果把一条染色体 分成 A-B-C-D 四个区域，则 A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D 分别发生了 C 区域的扩增 及缺失， 扩增的位置可以是连续扩增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的扩增， 如A-C-B-C-D。 什么是 structure variation （SV） ：基因组结构变异 染色体结构变异是指在染色体上发生了大片段的变异。 主要包括染色体大片段的插入和缺失 （引起 CNV 的变化） ，染色体内部的某块区域发生翻转颠换，两条染色体之间发生重组 （inter-chromosome trans-location）等。一般 SV 的展示利用 Circos 软件。 什么是 Segment duplication 一般称为 SD 区域，串联重复是由序列相近的一些 DNA 片段串联组成。串联重复在人类基因 多样性的灵长类基因中发挥重要作用。在人类染色体 Y 和 22 号染色体上，有很大的 SD 序 列。 什么是 genotype and phenotype 既基因型与表型；一般指

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