透明颤菌血红蛋白研究现状及其在中药中的应用展望_1
18页1、从本学科出发,应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性,便于研究生提出新见解,特别是博士生必须有创新性的成果透明颤菌血红蛋白研究现状及其在中药中的应用展望 【关键词】 透明颤菌属 关键词透明颤菌属; 血红蛋白类; 基因; 转基因 Current research status of Vitreoscilla hemoglobin and the prospective application in traditional Chinese medicine KEY WORDS Vitreoscilla; hemoglobins; genes; transgenes 氧传递直接或间接 影响 着需氧生物的初级代谢和次级代谢。在哺乳动物中,血红蛋白具有氧结合特性,过去曾认为这种氧结合蛋白只存在于哺乳动物中,近期发现,它几乎普遍存在于动物、植物和微生物中1。透明颤菌血红蛋白是由透明颤菌属中产生的一种可溶性血红蛋白,这种血红蛋白能在贫氧条件下被大量诱导合成,使透明颤菌在微氧条件下能够很好地生存。随着 研究 的深入,发现该基因的表达在转录水平上受氧浓度调控。因此在以溶氧为限
2、制条件的生物反应器中,尤其是在大规模、高密度微生物发酵和动植物细胞培养解决供氧 问题 领域具有潜在的 应用 前景。 1VHb的结构及特性 透明颤菌是一种专性好氧的革兰氏阴性丝状菌,属于贝日阿托氏菌属,在沼泽、腐烂植物等贫氧的环境中生长旺盛。VHb在透明颤菌中被发现,最初被认为是“细胞色素o(cytochrome o, Cyo)”蛋白,具有末端氧化酶的性质2。Cyo在不同的环境条件下可呈现三种不同的状态,即氧化态、还原态、氧合态,并可以相互转化;其中还原态是生理活性态,而氧合态则是富氧条件下的表现形式。它在577、544和420 nm处有最大吸收峰,若向溶液中鼓入CO气体,则可形成蛋白CO复合物,在566、535及41nm处呈现特征吸收峰3。但是随着1983年真正的Cyo的分离和确定4,实验表明该蛋白在光谱学和氧结合动力学性质上与氧合肌红、血红蛋白相似3,。1986年,Wakabayashi等6结合蛋白质初级结构、光谱性质、氧结合动力学确定了该蛋白的结构,并将该蛋白正式命名为透明颤菌血红蛋白。 VHb为同型二聚体,带有两个相对分子量为1575的亚基,每个亚基含有146个氨基酸残基和两个b
3、型血红素7。完整的VHb是可溶性的,但是脱去血红素辅基便不可溶。序列 分析 表明,VHb与其它真核生物蛋白氨基酸有明显的同源性,其中与黄羽扇豆血红蛋白的同源性最高,达到248。真核生物的血红蛋白形成8个螺旋区,而VHb每个亚基形成6个螺旋区。X射线晶体学表明VHb在近端和远端有独特的血红素端囊7,初步认为受E螺旋和F螺旋的干扰所致,通过氢键和TyrB10、GlnE7、ProE8及LysE11四个残基形成此结构。大多数种类的血红蛋白都有一个末端的His(E7)残基,该His残基通常通过氢键与氧结合。而VHb端囊的E7位置为Gln残基。定点突变表明,GlnEHis突变对VHb立体结构影响很大,野生型VHb解离常数比GlnEHis突变型蛋白大很多,因此,VHb与被束缚的氧亲和力小,从而使氧的传递速度更快9, 10,这与晶体学研究结果一致。而在N端存在某些结构差异,少了螺旋,这段序列曾被认为可能是前导肽,影响VHb的分布,使活性VHb主要分布在细胞周质11。近期用 电子 显微镜对VHb在透明颤菌和大肠杆菌中分布的分析结果表明,VHb主要分布在细胞质中而不是细胞周质,作者还认为细胞周质中的VHb
4、可能是VHb过量表达而被挤出的结果12。 VHb基因的克隆、表达与调控 0世纪80年代中期以前,学者们一直认为,可溶性Cyo在细胞呼吸中作为一种终端氧化酶而起作用。1986年,Orii等5对VHb与O2及VHb与CO结合的动力学进行了讨论,指出VHb可能是作为O2载体和储存物而起作用的。1988年,Dikshit等13根据已报道的VHb氨基酸序列合成探针,与透明颤菌基因组DNA进行杂交,在透明颤菌血红蛋白基因可能位区,得到了含有vgb基因的的DNA片段,且此vgb基因携带内启动子而不受载体启动子的控制;同年,Khosla等14也用类似 方法 克隆了vgb基因,在vgb重组大肠杆菌中表达时,同样得出了vgb基因是以自身启动子启动表达的结论。他们还测定了vgb基因的核苷酸序列,结果与Wakabayashi6报道的VHb氨基酸序列十分吻合。 将vgb基因转入大肠杆菌中表达,VHb的量与环境中的氧含量有关,vgb基因启动子在微氧条件下被诱导15。将vgb基因启动子与氯霉素乙酰转移酶和儿茶酚双加氧酶等报告基因融合并转入大肠杆菌中表达,发现在低氧条件下的报告基因产物比高氧条件下多57倍,说明vgb
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