模式生物的功能基因组学-从新的视角看老问题

1、模式生物的功能基因组学 从新的视角看老问题,1,原核生物如大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），单细胞真核生物如啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）都被作为传统的模式生物，这是因为它们结构简单、功能复杂、在实验系统中具有内在的优势。,E.coli 的非致病实验菌株（K-12）被列为最早的全基因组测序对象，它在原核遗传学、分子生物学、生物技术、尤其是DNA重组技术领域是首选的模式生物。 B. subtilis 是第一个进行全基因组测序的革兰氏阳性菌（1997），并且被作为研究生物化学、生理学、系统发育的遗传学范例。,S. cerevisiae 具有真核细胞的所有基本功能，并且人类疾病30的阳性克隆与酵母同源，对S. cerevisiae 基因产物的生物学作用做准确的测定是极其重要的一步，这有助于我们提高对遗传学上更复杂的、不易研究的多细胞动物的认识。,基因组序列信息表明，超过30的开放阅读框（ORFs），包括E.coli的染色体和B. subtilis 的染色体没有实际的功能。在S. cerevisia

2、e中大约6000个预测基因中的三分之一仍被归为未知细胞功能的阅读框。,因此，除了基因组结构分析以外，其它的系统研究得到的信息对大量的序列数据归类于生物学上有意义的位置是十分必要的。功能遗传学和相关的高通量综合技术学和方法学（例如，DNA微阵列、全基因组突变、双向凝胶电泳、双杂交系统、蛋白微阵列）试图在转录组学、蛋白组学、代谢组学、内部作用组学的细胞区域中确定新的基因。,用功能基因组学方法分析和综合技术阐明模式生物的细胞区域,生物信息学,计算机建模,DNA微阵列,质谱,噬菌体展示,双杂交系统,蛋白质芯片,2D-PAGE二维电泳,质谱,2 Escherichia coli（大肠杆菌）：模式真细菌,E.coli作为原核生物学中的模式实验生物，它的地位是无可比拟的。E.coli是最具特征的可自由生长的单细胞生物，并且它已用于研究细胞过程的生物学模式，如DNA的复制和修复、转录、代谢途径、应激反应、信号传导和遗传学规律。,尽管遗传学研究已有几十年，但E.coli K-12基因组中编码4,288个蛋白的38%的基因仍然不清楚生物学功能。这表明我们的认知还存在严重的不足，甚至是对于那些已被很好地研究

3、过的模式生物。,2.1Escherichia coli(大肠杆菌)基因组,E.coli 序列数据除了使全基因组功能分析的方法成为可能，同时也揭示了一些新的基因。基因组序列的生物信息学分析也已经预测了一些结构和调控元件，这些是各种生物化学途径或细胞机制方面知识所不能预见的。 在搜索序列相似性的基础上，芳香族化合物，如苯酚丙酸盐的降解途径的未知步骤被其他四个假定的mhp基因所揭示。,在基因组序列确定之前，mhp基因是已经存在的，但没有被鉴定。保守序列单元的出现确定了其中的一个mhp基因可能是由操纵子编码的代谢途径的转录调节子。序列研究揭示了第二个以前没有认识到的操纵子，该操纵子含有一些类似于假单胞菌（Pseudomonas）基因，能够降解芳香族化合物，如甲苯、苯、联苯。,假设的操纵子由三个基因组成，包括能够打开芳香环和氧化C1,C2的1,2-双加氧酶，一个类似于二氢-1,2-双加氧酶的开放阅读框和基因编码的铁氧化还原蛋白还原酶。,2.2 E.coli 转录组学,全基因组核酸序列使研究者们能够应用cDNA方法或者基于寡核苷酸的微阵列分析方法，根据特异性刺激物、遗传变异或者生理紊乱来评价基因组

4、转录图。,热激应答,热激应答，有时一般也称作应激应答，是一种内环境稳定的机制。这种机制是由活细胞在对温度升高不适应的情况下显示出来的。这种进化学上保守的分子对热反应的应答是一种限制性蛋白热激蛋白诱导合成的。除了热激外，其他不利的生理条件，如暴露在乙醇中或转入重金属，都能引起热激蛋白产量的提高。,在过热条件下，热激蛋白除了防止细胞蛋白变性和聚集外，也表现出一些对普通的生理生长所必要的功能，如辅助纠正多聚结构的组装，使新翻译的多肽折叠到它们自然的三级结构。因此，热激蛋白通常更多地被称为分子陪伴。,在细菌中，细胞对热激的反应首先在E.coli中被发现并得到细致地研究。由于热激反应的保守性，它已被作为一种模式系统来研究其他原核生物（如古菌）的调节基因的表达。 尽管微阵列提供了E.coli中对应于温度升高时的一系列潜在的参与者，但需要用与基因表达图谱相结合的其他方法给出一个完整的描述：细胞是如何整合和调控这些功能，对环境应激产生一致和快速的适应反应。,细胞代谢生长的转录组学分析,尽管我们已经知道一些与特定的生物合成或者代谢过程（如色氨酸生物合成）相关的必要的操纵子或基因，但不是出于这一目的的其它

5、的基因在还没有发展更综合更全面的实验方法之前还没有被鉴定，这些基因影响着某些代谢行为或者受到某些代谢行为的影响。,E.coli的色氨酸操纵子是分析的最透彻的细菌生物合成操纵子之一。色氨酸操纵子的五个基因（依次是trpE、trpD、trpC、trpB、trpA）编码分支酸转化为色氨酸途径的酶。色氨酸操纵子的转录受抑制蛋白TrpR的抑制调控，也受一种称为转录弱化作用的完全不同的调节模式的抑制调控。,功能基因组学，主要体现在微阵列介导的转录图，允许我们看到的不仅仅是微生物生理的某一焦点方面，如色氨酸代谢、特异性基因或调节子如何与基因表达的所有其他方面相互作用；而且还提供了一个观察基因组表达的视窗，如细胞在葡萄糖上生长的生理能力。,功能基因组学的价值在一项分析基因组表达的研究中得到了证实，即E.coli在含0.2葡萄糖的基本培养基上和在含0.2的肉汤培养基上对数生长后期的基因组表达。 E.coli细胞在含葡萄糖的富营养培养基上的生长速度（世代时间G=25min）是含葡萄糖的基本培养基的两倍（G=57min）,DNA阵列表明，某些功能上的基因转录的差异性与两种生长条件下细胞生理性状一致，因此提供

6、了依赖于基因表达和生物合成调节子全面调节的生长速率研究。 与119个（占所有标注基因的2.8）在富营养培养基上生长的基因相比，225个（占所有标注基因的5.2）在含葡萄糖的基本培养基上生长的基因有很高的表达水平（比例2.5倍）。,影响生长速度的开放阅读框被分成以下几种功能类型： 1、翻译装置； 2、氮代谢； 3、氨基酸生物合成； 4、维生素、辅助因子、辅基、载体的生物合成； 5、核苷酸生物合成； 6、脂肪酸生物合成和降解； 7、碳源和能源代谢； 8、细胞过程和整体调节子。,在以葡萄糖为碳源和能源的丰富培养基上E.coli生长的标志性特征是快速的生长速度，生物合成途径的停止，大分子合成基因，最显著的是蛋白质合成基因表达的增多。所有这些生理方面的特征在基因组表达水平通过利用全基因组序列信息和使用DNA阵列技术得以揭示。 微阵列分子也揭示了在基本葡萄糖培养基上生长的细胞，其碳和能量代谢基因的表达量是丰富培养基上生长时的4倍。,利用综合的转录图谱，我们能够开始对这些未分类的基因根据它们与相似的或相关的基因共调节来描述一项假定的功能。此外，从微阵列实验中得到的可测试的假设可能提供证据来证实未知基

7、因的生物学功能。因此，基于微阵列的转录图谱为进一步研究特征性模式生物如E.coli提供了进一步的动力。,NtrC（氮调节蛋白C）调节子,微阵列遗传学技术具有很多优势，它能够在特异性调节蛋白转录控制下检测所有的基因和操纵子。DNA微阵列技术促进了多基因网络的出现，如Ntr（氮调节）系统，它能根据E.coli细胞的生理状态信息执行一项细胞功能，通过吸收环境中可利用的氨得到氮，从而进行氨基酸生物合成。,对外部有限的氮的分子反应是在氮调节蛋白C(NtrC)的控制下基因转录的活化。NtrC蛋白激活54-基因的转录，氮的吸收控制（Nac）蛋白通过激活氮限制条件下70-基因的转录，从而作为NtrC和70-操纵子的适配器。 细胞以这种方式整合各组基因和操纵子的表达以获得全面的适应反应。这种多基因条件导致了基因产物的表达，这些产物能够允许细胞利用环境中任何残留的氨，然后转变为其他的氮源，从而在氮限制条件下能够最小化生长。,为了完全揭示E.coli的NtrC/Nac调节子，Zimmer和他的同事们（2000）使用DNA微阵列将NtrC激活基因过表达的突变株的整体转录水平与具有ntrC无效等位基因菌株中的整

8、体转录水平相比较。尽管氮的网络已经在E.coli中得到很深入的研究，但综合的基因表达图谱鉴定了许多新的NtrC调节子。,这些新的与ATP特异性结合的操纵子转运腐胺（potFGHI）、寡肽（oppABCDF）、二肽（dppABCDF）、核苷酸（nupC）和D-丙氨酸/D-丝氨酸/甘氨酸（cycA）的次级离子共转运。其他一些新鉴定的NtrC/Nac-控制基因，包括几个编码假定蛋白（ycdGHIJKLM, yeaGH, yedL）操纵子，再次证明了微阵列表达图谱对于在某些细胞功能中说明未知基因的能力。,从全基因组的角度检测NtrC/Nac调节子表明，NtrC控制了大约2的E.coli基因，其中大部分是底物转运的操纵子。这些基因的假定功能强调了E.coli在清除环境中含氮化合物的能力，作为抵御氮饥饿的第一道防线。,2.3E.coli蛋白组学,除了基因组结构分析和转录组学特征分析使用阵列技术外，蛋白组学分析依然是功能研究的重要组成，因为蛋白组学分析能够观察到基因表达的最基本水平。与蛋白组学分析相关的中心问题是序列分析预测的开放阅读框的可靠性，蛋白质的物理特征是否与那些开放阅读框预测的一致。而且，

9、已测序生物的蛋白组学的研究揭示了重要的特征，这些特征仅从基于基因组序列的理论蛋白组学是推断不出的。,其它的信息包括生物体内蛋白的丰度，后翻译修饰，蛋白水解。蛋白组学分析的方法通常包括双向凝胶电泳（2-DE），然后是用N-末端测序或质谱的点鉴定。已有的全基因组序列对从双向凝胶中提取的蛋白种类进行快速鉴定很重要。,仅是基因组序列不能对最终在细胞中产生的翻译产物在生化特性和功能上提供一个全面准确的描述。除了个别存在差异，大部分情况下，由实验得到的等电点值和分子量值与基因组序列预测得到的值相当一致。观察值和预期值之间的偏差可能由基因组序列的高度加工蛋白或错译造成。,用转录组学分析，蛋白表达和丰度的主要差异能在不同的细胞状态下测得。在Link和他的同事们的研究报道中，作者分别在最低限度的葡萄糖培养基中的指数生长期和丰富培养基中的稳定生长期检测了E.coli蛋白组的动态特性。2-DE分析不能全面的分析细胞的蛋白组学，几个在丰富培养基上稳定生长期早期鉴定的高丰度的蛋白质在葡萄糖最低限度培养基上生长的细胞中没有观察到。,这些蛋白质是：色氨酸酶（TnaA），用于色氨酸的降解和合成；半乳糖结合蛋白（MglB），在半乳糖转运入细胞的过程中起作用；饥饿诱导蛋白（Dps），它与DNA形成了稳定的复合物，因此保护DNA不被氧化毁坏。 这项研究表明了一个生物学原则：细胞改变它们的蛋白成分以适应变化的环境条件。,此外，还表明，更综合的分析方法，如最近发展的基因组学和蛋白组学的方法，正在改变我们观察活细胞的方法，甚至改变对已经被很好地描述过的模式生物的认识，如E.coli。蛋白组学能够被用来加强和支持由基因组序列分析提供的预测信息。,2.4 E.coli的模式代谢：计算机代谢组学,近来的基因组科学的重要目标是将细胞的核苷酸序列信息与生理功能相联系。 由于从基因组序列和功能研究得到的大量数据还在不断的积累，迫切需要能够在硅片上建立系统的阐述和发展复杂而完整的细胞系统的代表或数学模型。,图 ：用已有基因组序列、生理生化数据重建微生物代谢网络 以基因组序列为框架，再结合生理生化实验数据，能够在芯片上构建代谢途径的信息,第一步，利用现有的相关基因组数据，生理生化数据重新构建微生物的代谢图谱。 第二

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