病毒学- 病毒检验

1、第四节 病毒的检验,good,常用的病毒检验方法包括：,一、病毒的分离鉴定 二、病毒感染性的检测 三、病毒颗粒检测 四、病毒的血清学检查 五、病毒的分子(蛋白和核酸)检测,一、病毒的分离鉴定,病毒的分离与鉴定可为病毒感染提供最为直接的病原学证据，同时可为进一步的病毒学研究提供材料。 病毒的分离和鉴定（含义）：指从病人、带毒者、外界环境中采集标本经过适当的处理,采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法鉴定属于何种病毒,这一方法称为病毒的分离与鉴定。,病毒的分离与鉴定包括： 1、病毒材料的采集与准备 2、病毒的分离与培养3、病毒的形态学观察4、病毒的理化特性测定5、病毒的血清学鉴定及病毒的分子生物学鉴定等基本过程。,（一）标本的采取与送检,病料采集适当与否,直接影响病毒的检测结果。 一般可采集发病或死亡动物的组织病料、分泌物或粪便等,主要因动物及病毒的种类而异, 例如检测犬细小病毒或轮状病毒,一般应采腹泻幼犬或犊牛的粪便; 怀疑为口蹄疫的猪或牛,则应采其水疱液及水疱皮送检。,应注意下列原则：,1.对本身带有杂菌 (如咽喉拭子、粪便) 或易受污染的标本

2、，要进行病毒分离培养时，应使用抗生素。 2.因病毒在室温中易失去活性，标本应低温保存并尽快送检。 3.血清学诊断标本的采取应在发病初期和病后23w内各取1份血清，以便对比双份血清抗体效价的动态变化。,标本处理：,采集样本在接种细胞、鸡胚或动物之前,都需要做适当的处理,以保证病毒分离的成功几率。 采集的器官或组织样本：如肺脏、脑、肝、脾、淋巴结等,可取一小块进行充分研磨,加入含青、链霉素的Hanks液,离心取上清液作为接种物; 鼻液、脓汁、乳汁等分泌物或渗出液、粪便,应加入高浓度的抗生素,充分混匀后,置4冰箱内处理24h或过夜,离心后取上清做接种用; 咽喉拭子在取样后应迅速将其浸泡入含有2%小牛血清和一定浓度的青、链霉素的Hanks液中,充分刷洗棉拭子,反复冻融35次,离心后取上清液作为接种材料。,（二）病毒的分离与培养,细胞培养、鸡胚和实验动物可用于病毒的分离与培养,其中细胞培养是用于病毒分离与培养最常用的方法。 用于病毒分离与培养的细胞有原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系,一般说来,本动物的原代细胞最为敏感,但不如传代细胞方便易得. 例如猪传染性胃肠炎病毒初次分离最好用猪甲状腺原代或

3、二倍体细胞,但该细胞生长缓慢,通常用PD5(猪甲状腺细胞系)取代。 培养方法常用的有静置培养和旋转培养,有的病毒如轮状病毒,初次分离时旋转培养的成功率较静置培养高。,1、病毒的分离,不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。 主要有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。,（1）动物接种法,是最原始的病毒培养方法，根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位，如嗜神经性病毒（狂犬病毒）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。 动物的接种途径要根据病毒种类、实验动物种类、接种材料等选择合适的接种途径。动物接种途径的选择正确与否对提高病毒分离成功率也起到重要作用。,常见病毒常用实验动物及接种途径,P37,在动物实验的期间或结束时采集动物血液检测病毒或特异性抗体。 实验动物采血分为致死性采血和非致死性采血两种。 致死性采血是指尽量采集动物血,直至动物死亡。 非致死性采血是指采集一定量的动物血而不致动物死亡。 对采血动物,应在禁食24h后采血。采血应无菌操作。 不同动物采用不同的采血方法。常

4、用的有心脏采血法、眼眶采血法、颈静脉采血法、颈动脉采血法、耳静脉采血法等。根据实验动物和实验条件灵活选用。,实验动物采血,鸡胚对多种病毒敏感。 不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大,因此选择适当的接种途径是病毒分离成功的关键。 一般采用孵化914天的鸡胚，根据病毒种类不同，将病毒标本 接种于鸡胚的不同部位，最常用的鸡胚接种部位有：尿囊腔、绒毛尿囊膜、卵黄囊和羊膜腔等。,（2）鸡胚培养法,是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。,（3）细胞培养 (cell culture)法或组织培养法 (tissue culture),一般选择生长旺盛的敏感细胞用于病毒分离。 少数病毒例外,例如犬、猪等的细小病毒,病毒的复制有赖于分裂旺盛的细胞,因此需将病毒接种与细胞培养同步进行。 细胞培养技术在病毒发现、病毒研究、疫苗研制、抗病毒药物筛选等病毒学发展的历程中发挥着重要作用。,常见人类病毒的敏感细胞,P36,P36,（4）分子生物学技术,对体外培养的细胞、鸡胚、动物不敏感的病毒,可采用现代分子生物学技术,如基因克隆技术,对病毒的全基因进行克隆,构建

5、表达载体,并能表达出病毒样颗粒。,（三）病毒的鉴定,步骤： 1、初步鉴定 2、接种动物的观察 3、最终鉴定,1、初步鉴定,(1)根据临床表现、流行病学特征与标本来源。初步判定属于哪一类病毒 脑炎患者脑脊液 乙型脑炎病毒 秋季腹泻病人粪便轮状病毒 发烧小孩（下肢麻痹）粪便脊髓灰质炎病毒,(2)病毒的生物学特性,病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合,产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。,细胞病变效应,哪三种现象？,血吸附和血凝作用,有些病毒感染细胞后,细胞膜上可镶嵌着病毒基因编码产生的糖蛋白,其中有些能吸附特定种类的红细胞,或将细胞培养单层刮下后,经过适当处理,可以凝集特定种类的红细胞,此类糖蛋白在细胞表面形成刺突,称为血凝

6、素。 如流感病毒、副黏病毒、风疹病毒等感染细胞后可产生血吸附现象,或通过血凝实验来证实病毒的存在。,新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠红细胞 风疹病毒能吸附和凝集鸽子、绵羊等红细胞 病毒的血凝作用往往需要一定的pH和温度,利用血吸附和血凝集现象可以为初步判定属于何种病毒提供重要思路。,例子,干扰现象,一种病毒感染细胞后,可以干扰另一种病毒在该细胞内的增殖,这种现象称为干扰现象。 利用干扰现象可以检查出一些不引起细胞病变、血凝、血吸附的病毒。 如：鼻病毒就可以利用干扰现象进行初步鉴定。 实验组：感染人胚肾细胞管或培养板细胞用人或豚鼠红细胞做血吸附实验,如果阴性,用Hanks液洗涤3次,然后接种仙台病毒,33 培养48h,做血吸附实验。 对照组：正常细胞只接种仙台病毒。 实验现象：如果对照组血吸附阳性,而实验组阴性,说明先前接种的标本中存在能干扰仙台病毒增殖的病毒,此结果即为干扰试验阳性。,（3）病毒的理化特性测定,包括病毒核酸类型鉴定、耐酸性试验、脂溶剂敏感性试验、耐热性试验、胰蛋白酶敏感性试验等 通常以细胞培养或鸡胚培养为观察体系,应设立已知病毒为对照。,病毒的理化特性是病毒鉴定的重要依据,代

7、谢抑制法鉴定病毒核酸类型,病毒核酸类型鉴定是病毒理化特性测定的最主要指标。 添加氟脱氧尿核苷(FUDR)或类似物于病毒培养物中,病毒复制被抑制者,即为DNA病毒,否则为RNA病毒,也可用DNA酶或RNA酶分别作用,以判定核酸的性质。 绿豆芽酶可降解单股核酸,用它可进一步鉴定核酸是单股或双股。,可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对其进行鉴定。但技术要求较高。 近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核酸型鉴定的可行性大为增加。 （观看PCR视频）,脂溶性试验,用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理者比较其TCID50的变化,以判断是否敏感。 乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病毒的脂质包膜。 有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理能使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂溶剂有抵抗力。因此,用乙醚等可以鉴定所分离的病毒是否有包膜。,病毒粒的结构模式图,壳粒,衣壳,核心（核样物）,核衣壳,包膜,包膜病毒,包膜子粒,处理方法:,将病毒悬液20003000r/min离心20min,取上清液,分成两组： 一组为试验组：按与乙醚4:1的比例振荡混合均匀,管口密封好,4过夜后,20003000

8、r/min离心20min。此时液体分为两层,上层为乙醚,下层为病毒液。吸取下层部分,避免混有乙醚。 另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。 将两组的病毒液同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度明显降低,与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感,属于有膜病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说明病毒对乙醚有抵抗力,属于无膜病毒。,耐酸性试验,耐酸性试验和脂溶剂敏感性试验是最常做的两项理化指标。 耐酸性试验设置缓冲液pH为3和7的病毒做比较。 通过肠道传播的病毒对酸有抵抗力,借此可鉴别某些病毒。 如肠道病毒与鼻病毒同为RNA病毒,肠道病毒对酸有抵抗力,而鼻病毒则没有。,处理方法:,试验组：病毒悬液用0.1mol/L的HCl调pH至3.0,37放置2h后,用5.6%的NaHCO3调pH至7.2 对照组：除了不加酸外,其他步骤和试验组相同。 将两组同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴度明显降低,与对照组有显著差异,说明病毒对酸敏感,不属于肠道病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说明病毒对酸有抵抗力,属肠道病毒。,2、接种动物的观察,根据动物的感染范围,可初步推断属于何种病毒。 接种动物的观察

9、是非常重要的,通过观察试验动物的反应有时也可初步鉴定何种病毒。 每天都需要观察,有时1d需要观察数次。,观察指标:,动物发病的潜伏期,病毒感染都有一定的潜伏期。因此,潜伏期在病毒的初步鉴定方面也是非常重要的。如乙脑小鼠脑内接种潜伏期一般为4d,狂犬病脑内接种潜伏期一般为68d。 接种动物的饮食情况是否有变化,活动与饮食能力是否发生改变,粪便是否有变化。 每天在同一时间测量动物的体重和体温,比较接种前后变化情况。 观察局部或全身性反应,如出现毛松、软弱无力、震颤、不安、抽搐,甚至死亡等全身症状,可考虑神经系统感染的可能性。 对照组不接种病毒,用生理盐水代替,其他步骤和观察指标与试验组完全相同。,3、最终鉴定,病毒的最终鉴定需要免疫学方法、分子生物学方法、电子显微镜与免疫电子显微技术等特异性方法加以鉴定。 （1）病毒的血清学鉴定 （2）病毒的分子生物学鉴定 （3）电子显微镜技术,（1）病毒的血清学鉴定,病毒分离后,可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体,对分离毒株进行血清学鉴定,以确定病毒的种类、血清型及其亚型。 常用的血清学试验有血清中和试验、血清抑制试验、免疫荧光试验等。 此外,可采用一些血清学技术如免疫沉淀技术和免疫转印技术分析病毒的结构蛋白成分。,中和试验,基本原理：特异性的抗病毒免疫血清（即中和抗体）和病毒体表面的抗原结合后,使病毒不能吸附于敏感细胞,或两者结合后抑制了病毒的穿入和/或脱壳过程。因此,病毒就失去了感染的能力。 中和试验是以测定病毒的感染力为基础的,试验必须在培养的细胞内,或动物、鸡胚等活体内进行,而且都必须是对病毒敏感的。以病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据,判定中和抗体的滴度。中和试验需要设对照试验。,结果判定的科学依据：,用细胞培养进行试验时,可依据细胞病变情况、蚀斑数量、颜色反应等。 用鸡胚进行试验时,可依据鸡胚的死亡数、绒毛尿囊膜斑点数量和特征、血凝素产生情况等; 用动物进行试验时,可依据动物死亡数、发病数、出现症状数等。,操作步骤：,中和试验常用的有

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