国家自然基金标书-木材形成的调控机制研究

1、项目名称：木材形成的调控机制研究首席科学家：卢孟柱 中国林业科学研究院起止年限：2012.1-2016.8依托部门：国家林业局一、关键科学问题及研究内容拟以杨树等主要用材树种为研究材料，采用次生维管组织再生及离体培养等实验系统，利用遗传学、分子生物学、生物化学、基因组学、生物信息学等研究手段，研究纤维素、半纤维素和木质素的合成机理；解析细胞壁主要成分协同排列、沉积及遗传因子对该过程的调控机制；阐明激素、多肽、信号转导分子等对木质部细胞分化的调控，以及材性相关基因位点的基因组定位及遗传效应分析。为速生树种材性改良的分子品种设计提供理论和技术支持。1纤维素、半纤维素和木质素的合成与调控以杨树等材料为研究对象，解析纤维素合酶复合体结构与作用机制；研究MYB、NAC等转录因子在调控CESA基因及纤维素合成中的影响以及相关蛋白KOR、BC1和BC15与纤维素合酶复合体的互作及功能，阐明它们参与纤维素合成的分子机制；研究CSLD5、CSLD6、BC11、BC14等同源基因在木聚糖合成中的功能，解析半纤维素（木聚糖）合成机理及这些基因与纤维素合成关键基因互作、应答的机制；次生壁木质素合成关键基因（4

2、CL基因和CAld5H基因）的调控机理，鉴定直接调控木质素合成的MYB类转录因子的功能。2细胞壁形成与木材材性的调控利用应拉木形成体系研究细胞壁形成过程中起调控作用的miRNA，并从基因组水平鉴定杨树miRNA的靶基因，及其对木材细胞壁形成的影响机制；基于已有的转录组学数据，对杨树中参与细胞壁形成的关键基因进行深入的转录调控分析，筛选与次生壁加厚相关的转录因子，研究其作用模式和调控机制；开展细胞骨架调控纤维素沉积的分子机理，包括微管、目标蛋白和细胞壁三者间的调控关系和作用方式，揭示微纤丝角度和纤维聚合度与纤维素的沉积与组装的关系。3.形成层干细胞维持、分化以及木质部发育的调控机制利用次生维管再生等系统，研究激素、短肽、信号转导因子和转录因子等对形成层细胞发生、分化以及次生木质部不同细胞类型发育的的影响，揭示控制不同管状分子、纤维分子类型的调控因子，阐明其作用机制；利用转基因技术获得不同调控因子表达水平的杨树材料，分析形成层模式变化并结合芯片技术分析全基因表达谱的变化，揭示细胞分化相关调控网络；分析导管分化模式与细胞程序化死亡关系，特别是分析不同类型细胞PCD上游起始因子的特性。4.木材

3、和材性形成的比较基因组学利用生物信息学、系统发育和比较基因组学等手段，比较不同材性林木（10个）和草本（35个）物种中纤维素、细胞壁沉积和木质部细胞分化等相关基因（基因家族）的保守与变化式样；重点阐述木材及材性基因的共性和特性；筛选木材和材性形成与调控中尚未被仔细研究过的关键基因，通过杨树等模式植物进行转基因功能验证。5.木材品质性状QTL定位、解析与克隆利用杨树、桉树等种质资源材料及杂交群体，进行木材品质性状QTL分析，通过目标基因组局部区域图谱加密和增加作图个体数量，提高QTL定位精度；分析QTL与环境的互作以及QTLs之间的上位性效应，分析材性相关eQTL的基因组分布特征及效应；主效QTL区间序列测序，发现作图亲本在相应区域的杂合基因位点；利用生物信息与图位克隆相结合的方法，克隆主效基因；对克隆的主效基因开展表达调控研究，并探讨相应基因在木材形成中的作用。6.木材品质性状的联合遗传学研究以重要用材树种的自然群体为试材，采用全基因组和候选基因的联合遗传学策略，系统地鉴定重要木材纤维性状形成关键基因的功能、等位基因序列变异和等位基因效应，开发功能SNP标记；研究基因内与基因间SNP位

4、点及其组成的单倍型对木材性状的遗传效应，及遗传互作方式；发掘一批在林木自然群体中具有育种价值的功能SNP位点，初步建立林木木材品质优异新种质的早期筛选与鉴定技术体系。二、预期目标1.总体目标本项目针对严重制约我国人工林木材品质改良的问题，围绕木材形成的遗传调控这一重大科学问题，以杨树等我国主要用材树种为研究材料，应用基因组学、分子遗传学、生物信息学等理论和技术，研究纤维素、半纤维素和木质素的合成机理, 解析细胞壁主要成分合成、排列、沉积的调控机制；揭示激素、信号转导分子等对木质部细胞分化的调控机制；分析控制木材品质性状的遗传位点及遗传效应，构建调控木材材性改良的模型，为品质改良的分子设计提供依据；发掘品质改良重要的调控因子，包括染色体区段/基因簇/基因/等位基因、miRNA等；提出针对不同材质分子设计策略、方法，为新品种培育提供理论和物质基础。 通过项目的实施，将进一步提升林木木材形成的调控理论，提高我国林木育种在理论和技术上的原始创新能力；建立林木材性改良的分子技术体系，为优质、高产林木育种提供支撑；保持我国在人工林特别是速生林木品种培育的国际先进地位，最终为我国木材安全提供理论和技

5、术保障。 2.五年预期目标 （1）阐明细胞壁主要化学成分的合成、纤维沉积方式的调控机理，鉴定出主要的调控因子。 （2）揭示形成层干细胞维持、分化以及木质部不同类型细胞发育的遗传调控机制，鉴定出重要调控因子。 （3）解析木材品质性状形成相关基因片段/基因簇/基因，开发基于功能基因的分子标记，初步建立一套林木木材品质优异的新种质早期筛选与鉴定技术体系。（4）鉴定遗传因子80-100个、遗传标记120-150个，获得调控木材形成的遗传因子（基因片段/基因簇/基因及miRNA等）20-30个；分子标记10-15个；获得木材品质显著改良的新种质20-30份。 （5）培养硕士、博士研究生80-100名，培养青年学术骨干8-10人。 （6）发表SCI论文70-80篇（累计影响因子200以上）；申请专利15-20项。三、研究方案1. 学术思路 木材形成是一个复杂的多基因调控网络，涉及木质纤维的合成及在细胞壁上的沉积，木质部不同细胞类型的分化以及个体多年径向生长等过程的调控。因此，以模式草本植物为研究材料取得的成果需要在木本植物上加以验证，而且要针对林木本身，进行木材形成的调控机制研究，才能获得系统性强

6、、具有应用前景的研究成果。木材材性的调控包括了从亚细胞（细胞壁）、细胞、组织到个体的各个层次，需要围绕核心科学问题即木纤维的合成、细胞壁沉积方式、木质部不同类型细胞的分化和材性的遗传调控，运用分子遗传学、生物化学、基因组学、生物信息学等理论和方法，分离和克隆细胞壁和木纤维形成的关键基因并分析其功能；利用细胞学以及转录组等手段研究木质部细胞分化的遗传调控；利用比较基因组学研究不同材性物种的共性与特性，筛选材性控制的关键基因和关键位点；利用转基因、QTL以及群体遗传学等手段，揭示关键基因变异对材性的影响，为我国速生优质林木培育提供原创性的理论和技术。2. 技术途径 本项目将根据总体目标和目前该学科的发展趋势，充分利用已有的杨树、桉树等基因组信息、已构建的多种林木遗传图谱和功能基因组研究资源平台，从分子、细胞、组织、个体、群体等层面上系统解析木材形成的遗传调控机制。在分子水平上，针对木材主要结构组分（纤维素、半纤维素及木质素等），采用正向与反向遗传学等策略阐明其生物合成的分子基础。在细胞水平上，针对木材细胞壁沉积与加厚过程，利用转录组数据、分子生物学与生物化学的手段揭示细胞壁形成的调控网络，

7、阐明细胞骨架调控纤维素沉积的基础。在组织水平上，利用细胞生物学、功能基因组学等手段研究木质部细胞分化的遗传调控机理。在群体水平上，组合利用基于自然群体的联合遗传学及基于家系的QTL作图技术检测控制木材品质性状QTL的效应，分析重要基因的功能，解析基因内具有育种应用价值的功能SNP标记位点。在物种水平上，利用比较基因组、生物信息学与系统生物学等手段，研究物种间木材与材性形成基因的共性与特性。最终阐明木材形成和木材品质性状遗传控制的机制，为木材材性定向分子设计与改良奠定理论和技术基础。 主要研究路线如下图：四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 确定调控CESA基因表达或纤维素合成的MYB和NAC类转录因子，开展候选转录因子的功能研究；完成参与纤维素合成的关键蛋白BC15和BC1的功能研究。2. 分析和鉴定木本和草本植物miRNA的差异，以及对木材细胞壁形成的关联。3. 筛选参与形成层细胞发生、分化的基因及信号转导因子；订购拟南芥同源基因突变体，完成株系纯化，进行部分杂交实验。4. 完成胡杨和鹅掌楸两个林木物种的基因组精细结构分析和基因精确注释，预测与木材形成相关的基因。5. 完成与木材品

8、质性状相关的分子标记标记开发，并进行作图标记筛选。6. 分离在木质部高丰度差异表达的100个酶基因或转录因子基因，并分析其序列变异模式、SNPs与INDELs多样性。1. 确定调控CESA基因表达或纤维素合成的MYB和NAC类转录因子，完成参与纤维素合成的关键蛋白BC15和BC1的功能研究；鉴定和克隆木材细胞壁形成的关键基因10-15个；分离形成层和次生维管组织特异表达的基因；完成对胡杨和鹅掌楸的基因组分析；完成种质材料材性状状表型变异分析研究，开发并筛选用于作图的分子标记；获得在木质部高丰度表达的100个酶基因及转录因子基因在林木自然群体中的SNPs与INDELs序列多样性。2. 发表学术论文14-16篇，申请专利3-4项，培养研究生18-20人。第二年1. 明确MYB和NAC类转录因子在调控CESA基因表达或纤维素合成中的功能，开展CSLD5、CSLD6在木聚糖合成中的功能研究。2. 解析特异参与形成层分化和应拉木形成的miRNA的作用机制。3. 进行转基因和突变体植株分析；研究Caspase-3蛋白酶活性的基因在管状分子分化、次生壁形成中的作用。4. 鉴定出参与木材发育与材性形成

9、过程的相关基因和基因家族，以及物种材性差异形成的特异基因。5. 构建木材品质性状QTL定位群体的遗传图谱。6. 选用准确、高效的SNP或INDEL基因型分析方法对上述候选的SNPs与INDELs位点进行群体中每一单株的基因型测定和分析。1. 明确MYB和NAC类转录因子类在调控CESA基因表达和纤维素合成中的功能，完成CSLD5、CSLD6等基因的功能研究；完成2-3个木材细胞壁形成的关键基因功能的解析；获得与次生生长相关的拟南芥突变体，并通过互补试验、杂交试验研究相关基因功能；揭示木材形成和材性调控的关键基因、物种特异性的新基因与基因关键位点；构建木材品质性状作图群体的基本遗传图谱；获得SNP或INDELs位点在林木自然群体或杂交群体中的基因型，并建立这些位点的基因型数据库。2. 发表学术论文13-15篇，申请专利4-5项，培养研究生17-19人。第三年1. 完成杨树等植物纤维素合酶复合体的结构与作用机制研究；深入研究KOR、BC15、BC1同源基因在杨树中的功能。2. 完成2-3个木材细胞壁形成的关键基因功能的解析；应用功能解析的新基因，通过基因工程手段，开展细胞壁改造的研究。3. 利用生物信息学技术研究影响形成层活动、维管组织细胞分化以及次生壁形成基因调控网络；研究生长素相关基因、CLE多肽及其受体激酶、NAC基因家族、Caspase-3蛋白酶等基因对形成层活动、木质部细胞类型、细胞壁厚度及纤维长宽等的影响。4. 确定相关基因在木材发育和材性形成调控过程中的表达模式，进一步筛选木材与材性形成的相关基因。5. 定位木材品质性状相关的QTL及eQTL，并分别阐明检测到的QTL的效应。6. 在全基因组水平上研究基因间SNP或INDELs等位位点及其组成的单倍型对木材品质性状的遗传效应与互作方式。1. 初步揭示KOR、BC15和BC1在木材品质中的作用；完成2-

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