离心技术在植物病理学中的应用

1、离心技术原理及其在植物病理学研究中的应用,主要内容,离心技术的定义和应用 离心技术的基本原理 离心机的主要构造和类型 三种常用离心方法 超速离心机的结构与操作 注意事项 高速离心机的结构与使用 离心技术应用举例,病原生物样品的分离和制备,离心技术，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。主要用于各种生物样品的分离和制备。 离心技术在生物科学研究领域，应用十分广泛，每个分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。,离心技术的基本原理,当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： F = ma = m2 ra 粒子旋转的加速度， m 沉降粒子的有效质量(g)，粒子旋转的角速度(弧度/秒)， r粒子的旋转半径( cm )。,相对离心力(Relative centrifugal force，RCF),离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离“ RCF ” 或者用数字乘“g”来表示，例如25000g，则表示相对离心力为25000。相对离心力是

2、指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g” （980cm/sec2），此时“RCF”相对离心力可用下式计算： RCF = 1.11910-5(rpm)2 r ( rpm revolutions per minute，rpm/min , r为半径cm ),平均半径的计算,在上式中，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。但由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径“Rav”代替： Rav=(RminRmax) / 2r的测量如右图所示：,Rmin,Rmax,Rav,在上式的基础上，Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图。 在将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。,科技文献中离心力的表述方式,一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g” 表示。计算颗粒的相

3、对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。 因此 在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFav），即离心管中点的离心力。,定义：特定大分子在特定条件下在离心场中的沉降速率。它是某种大分子的分子量、密度及其颗粒形状的综合体现。 S20W定义为一种颗粒20下, 在浓度为零的纯水中的沉降测量结果。S20w实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。 (S= Svedberg unit) 斯韦德贝里,沉降系数 (Sedimentation Coefficient , S20W),沉降速度（Sedimentation velocity）,沉降速度是指在一定离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。,式中r为球形粒子半径；d为球形粒子直径；为流体介质的粘度；p为粒子的密度；m为介质的密度。 粒子的沉降速度与粒子半径的平方、粒子的密度和

4、介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加。 当pm，则S0，粒子顺着离心方向沉降。 当pm，则S0，粒子到达某一位置后达到平衡。 当pm，则S0，粒子逆着离心方向上浮。,离心机的主要构造和类型,离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。 实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大。 分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和分子量等。 分析性离心机都是超速离心机。,三种离心机转头工作原理,固定角转头水平转头垂直转头,角转头工作情况,水平式转头工作情况,垂直转头工作情况,三种常用离心方法,差速沉降离心法差速区带离心法(速度区带离心法)等密度区带离心法(平衡密度梯度离心法),差速沉降离心法,即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。,差速区带离心法工作示意,等密度区带离心法工作示意

5、,等密度区带离心法样品收集,等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 收集区带的方法有许多种，例如： 用注射器或滴管由离心管上部吸出。 有针刺穿离心管底部滴出。 用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。 用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。,梯度溶液的制备,梯度材料的选择原则作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：,与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。 可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。 不会对离心设备发生腐蚀作用。 容易纯化，价格便宜或容易回收。 浓度便于测定，如具有折光率。 对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。,这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。,梯度材料的应用范围 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实

6、验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400,000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。 氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。 Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮(PVP),渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下稳定，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。,超速离心机外形结构,超速离心机内部结构,离心仓内部结构,不要拆卸超速适配器,Fig. 1-2-3.

7、 Overspeed Adapter and Disk,离心管（瓶）的摆放方式,速度时间的调整,温度、加速、减速调整,超速离心机的操作程序,选择与所用转头相对应的离心管，按要求装入样品，在天平上两两调平衡后，对称放入转头中。 打开电闸开关及离心机电源开关。 打开离心机舱盖，用手托着角转头放在离心舱内的转轴上，注意一定要对正放好。 关上离心机舱盖。 设置运行条件：角转头的“ACCEL”和“DECEL”为9，水平转头的“ACCEL”和“DECEL”为8，按一下“ACCEL”或“DECEL”后，用上下键选择后按“ENTER/ RECAL”；设置“SPEED”（速度）、“TIME”（时间）、“TEMP”（温度）方法同上。 按下“VACUUM”抽真空，直至“VACUUM”左右两个灯全亮了，表明真空达到要求。 按“ENTER/RECAL”显示已设置的运行条件。 按“START”开始。 运行结束，至“SPEED”显示为零时，按一下“VACUUM”放真空，至无嘶嘶声为止。 打开离心机舱盖，取出转头放在转头座上，取出样品。 关上离心机舱盖，关闭电源，关上电闸。,超速离心机使用注意事项,样品一定要平衡，一

8、一对应放入转头内。严禁在离心仓内加样品。 离心管的选择和加样一定要符合要求，不同的转头使用不同的离心管，角转头用薄壁管或厚壁管，薄壁管装样品时必须装满，且用专用的工具拧紧；厚壁管装样品不得超过最大允许体积；水平转头用PA管，注意离心管对酸碱的稳定性。 使用水平转头时，要将离心管放在吊蓝内平衡，吊蓝和盖和下面部分上的标号要对应，拧紧到盖的凹点与下面部分的小圆点对应为止，不能用力过大。吊蓝要挂在转头的相应位置上，要对号入座，吊蓝要挂住，放到机舱后用小镜子再检查一下是否挂好，防止在离心过程中飞出打坏离心机舱。 要抽真空完全后才能按“START”。 待“SPEED”为0时，按“VACUUM”放气。 拿放转头时，注意角转头要托着转头的主体，而不要提上面的把手；水平转头要一手提上面的提手，一手托着，另外，离心时必须将上面的提手拿下。 每次离心完毕后，注意将转头取出，如有液体散落及时清理，关上离心机舱盖，关上电源和电闸。,转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。 若要在低于室温的温度下离心时。

9、转头在使用前应放置在冰箱4度或置于离心机的转头室内预冷。 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。,高速离心机外形结构,超离心实验举例,利用差速离心的方法提纯WYMV 用匀浆器将病叶匀浆，加入3倍体积的柠檬酸缓冲液（W/V）和0.1%的巯基乙醇。 双层纱布过滤，加入1/4体积的氯仿，低温搅拌10分钟。 静置半分钟后倒出上清，8000 rpm离心20分钟，取上清加PEG沉降后10000rpm离心20分钟。 取上清，40000rpm 超离1小时（每管铺5ml蔗糖垫），去上清，沉淀用缓冲液悬浮，10000rpm高速离心20分钟，取上清。 40000rpm 超离小时去蔗糖，沉淀同上悬浮。 使用水平转头精提纯：每4ml病毒悬浮液加1.33g CsCl，29000rpm 超离18小时。 用针头将病毒带取出，加入缓冲液稀释5倍，40000rpm 超离1小时，沉淀溶于1ml缓冲液中，-20保存。,小麦黄色花叶病毒 Wheat yellow mosaic virus,分子生物学常用小仪器使用规程,含超净工作台 光照培养箱 制冰机 组织匀浆机 纯水器等,谢谢！,

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