分子生物学常用技术
102页1、分子生物学 常用技术核酸的分子杂交Nucleic acid hybridization分子杂交的原理: DNA具有变性的特点 变性的DNA还能复性 分子杂交的概念 分子杂交的原理:用已知的DNA序列制 成探针,来检测末知的样本DNA。当条件改变时当条件复原时单链DNA被 同位素标记 后制成探针核酸分子杂交的基本过程:首先要确定检测的目标,即检测的目的 核酸片段,这个片段的序列必须是已知的 。根据此设计一个探针(与检测目的核酸 互补的序列),并对其进行合成和标记。再通过杂交实验来完成探针对目的核酸 的检测。 分子杂交的形式:液相杂交固相杂交它们之间的区别和优劣固相杂交的一般过程1. 首先设计、合成探针。2. 收集标本,并提取核酸。3. 将提好的核酸样本点到固相支持物上 。4. 封闭。5. 通过变性和复性完成杂交。6. 漂洗7. 放射自显影 核酸分子杂交技术的演变斑点杂交southern blotnorthern blot原位杂交芯片技术斑点杂交southern blotsouthern blot原位杂交 染色体原位杂交 组织切片上的原位杂交抗衰老基因klotho基因的原位杂交芯片技术Ge
2、neChip Array Construction11 mMillions of copies of a specific oligonucleotide probeImage of Hybridized GeneChip Array500,000 different complementary probes Single stranded, labeled targetOligonucleotide probe*GeneChip ArrayHybridized Probe Cell1.28cm1.28cmDNARNADNA and RNA MonitoringDNA and RNA MonitoringGenotyping: Is it A or B?Gene Expression: Which genes? How much?Eukaryotic CellDec 2002 Golden PathBlue = STR from CIDR panel Black = GapsMedian intermarker distance: 4.7 MbMean intermarker dist
3、ance: 5.6 MbMean genetic gap distance: 8.9 cMAverage Heterozygosity 0 .76Median intermarker distance: 105 kbMean intermarker distance: 210 kbMean genetic gap distance: 0.32 cMAverage Heterozygosity 0 .37Dec 2002 Golden PathRed = at least 1 SNP per 100 kb Black = Gaps10k Coverage: Genome 11,555 SNPsMedian intermarker distance: 8.5 kbMean intermarker distance: 23.6 kbAverage Heterozygosity 0 .30Average minor allele frequency 0.22July 2003 NCBI bld 34Red = at least 1 SNP per 100 kb Black = Gaps in
4、genome coverageMapping 100K Coverage: 116,204 SNPs 92% of genome within 100kb of a SNP 83% of genome within 50 kb of a SNP 50% of genome within 15 kb of a SNP 25% of genome within 5 kb of a SNP聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR)PCR技术的形成及发展 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司 人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有 划时代意义的聚合酶链反应。其原理类 似于DNA的体内复制,只是在试管中给 DNA的体外合成提供一种合适的条件 摸板DNA ,寡核苷酸引物,DNA聚合 酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性 及延伸的温度与时间, 合成DNA的原料。 PCR示意图PCR的改进与完善 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,其缺点是: Klenow酶不耐高温, 90会变性失活,每 次循环都要
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