关于rna的相关操作技术总结
41页1、 RNA 相关操作技术RNA相关技术主要包括: RNA 提取、电泳技术 RNA逆转录合成cDNA 体外转录合成RNA RNA杂交Northern杂交 原位杂交技术 基因芯片技术 cDNA文库的构建RNA概述细胞中的总RNA包括mRNA,rRNA ,tRNA以及一些小RNA(sRNA)。一个典型的动物细胞约含10-5g RNA,其中:80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA 的1%-5%rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列,特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。RNA的浓度和纯度可以通过测定其OD260和OD280 来判断。OD260为1时相当于浓度为40g/ml,而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之间,表示所提取的RNA纯度较好,如果样品中有蛋白质或酚污染,则OD260/ OD280的比值将明显低于1.8。1、mRNA的分离纯化PolyA T-tract mRNA的 分离纯化过程简图。2、逆转录合成cDNA构建cDNA文库3、Northern 杂交技术基本原理:Northern杂交是研究真核细胞基
2、因表达的基本方法。其基本原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。主要用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。 Northern杂交基本操作流程1)RNA变性及电泳 氢氧化甲基汞(很好的变性剂,但具有挥发性,且有毒) 乙二醛醛/甲酰酰胺 甲醛醛和甲酰胺对对RNA进进行预处预处 理,后在含2.2M甲醛醛的凝胶中电电泳2)RNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 3)核酸探针的标记及杂交 4)洗膜与检测4、RNA原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)RNA原位杂交用放射性或非放射性(如DIG、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应,若细胞中存在与探针互补的mRNA分子,两者杂交产生双链RNA,可通过放射性标记或经酶促免疫显色,对该基因的表达产物做出定性定量分析。mRNA的互补链,杂 交信号集中于纤维 细胞中。负对照,mRNA 的同义链, 无 杂交信号。正对照,UBQ10 杂交信号遍布 于整个胚珠。RNA原位杂交基本操作流程(一)用石蜡包埋材料1)材
3、料的固定: 固定液:FAA固定液、多聚甲醛固定液 固定的材料不宜过过大,否则则固定液不易渗透 抽气:抽气、放气宜缓缓,尽量避免对细对细 胞造成伤伤害 材料在固定液中浸泡的时间时间 不宜过长过长 ,否则杂则杂 交信号会减弱2)脱水将乙醇或戊二醇配制成由低到高的浓度梯度,对固定好的材料进行逐级处理。如: 50%乙醇70%乙醇85%乙醇90%乙醇100%乙醇3)透明完全脱水的材料经下列二甲苯梯度处理(用乙醇配制)25%,1h50%,1h75%,1h100%,1h,重复两次4)包埋将石蜡切成小碎片,加入到材料中(浸泡在二甲苯中)至饱和,42放置一天,5860 放置两天,期间换34次石蜡,最后将材料和石蜡一起倒入小纸盒中,凝固后,4 保存。(二)切片和展片切片厚度710 微米(三)探针的制备体外转录合成sense探针、antisense探针(DIG RNAlabeling kit),探针浓度100400ng/ul为宜(四)材料脱蜡和复水脱蜡:100%二甲苯33%二甲苯复水: 100%乙醇10%乙醇水(五)杂交杂交液由A和B组成,每张片子大约需100150ul杂交液;在0.3M NaCl-50%甲
4、酰胺溶液形成的湿室中,42杂交过夜。(六)洗片用RNase A对材料进行处理(七)显色加入anti-DIG-Ap,进行显色;镜检,拍照蛋白相关操作技术一、蛋白与DNA相互作用 (一)酵母单杂交系统(Yeast one-hybrid system)该技术是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术,在酵母细胞内研究真核生物中 DNA-蛋白质之间的相互作用,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。基本原理:将顺式作用元件与最基本启动子(minimal promoter,Pmin)相连并将报告基因连到Pmin下游,将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域(transcription-activating domain, AD)融合表达载体导入酵母细胞,该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合,就激活Pmin启动子,报告基因表达。 从拟南芥cDNA文 库中筛选与顺式元 件DRE结合的转录 因子示意图。(二)噬菌体展示技术基本原理:将已知的启动子DNA片段与固相支持物结合;以改构的噬菌体为载体,把待选基因片段(编码启动子 DNA结合蛋白的cDNA)定向插入
《关于rna的相关操作技术总结》由会员xzh****18分享,可在线阅读,更多相关《关于rna的相关操作技术总结》请在金锄头文库上搜索。
爱心树活动教案
世界文化之旅0
七年级学年知识归纳
七年级历史下册第二单元第12课《蒙古的兴起和元朝的建立》课件人教新课标版
一片美丽的叶子
非谓语动词 (6)
[中学联盟]江苏省太仓市第二中学七年级英语上册教学课件:Unit3READING1 (2)
“数与代数”教材修订说明
2014年7月师院培训
字理教学快捷入门之一20140521s
议论文写作指导之新材料作文审题立意 (2)
压缩语段 (2)
琵琶行课件 (2)
2014年各年级的教学计划和建议
(苏教版)五年级数学下册找规律第二课时
秋姑娘的信 (5)
苏教版数学五年级上册《复式条形统计图》课件 (2)
【名校课时通】2014届九年级化学全册第二单元探秘水世界第三节原子的构成名师教学课件鲁教版
《逻辑与语文》课件2
《检阅》[1]
2022-08-27 60页
2022-01-06 52页
2021-07-05 46页
2021-07-05 4页
2021-05-02 23页
2021-05-02 17页
2021-05-02 23页
2020-08-03 9页
2020-08-03 8页
2020-08-03 5页