第三章 发育生物学研究技术和方法

1、Development al Biology第三章 发育生物学研究技 术和方法Development al Biology 在第一章回顾发育生物学的历史时，我们已了 解了实验技术对发育生物学发展的突出贡献， 特别是分子生物学的兴起给发育生物学的发展 所带来的活力。事实上，发育生物学是一门实 验性很强的学科，很多重要的发育理论和发育 模型都是在大量实验结果的基础上建立起来的 。其中涉及各种各样的研究技术和方法，既有 传统的胚胎学和细胞学方法，如胚胎移植、胚 胎分割、细胞核移植等，又有新发展的分子生 物学方法，如显微注射、原位杂交,基因转移及 基因功能分析等。本章将重点介绍发育生物学 研究中的几种常用方法 Development al Biology 第一节 显微注射 显微注射(microinj ection)是发育生物学 研究中最经典而又使用最为普遍的一种 方法，特别是近十几年来通过基因转移 创造生物反应器这一具有明显商业价值 的应用研究的开展，更显现出这一技术 的活力。本节将介绍显微操作系统、注 射用卵子或胚胎的准备、操作过程等。Development al Biology 一显微操作

2、系统 显微操作系统已经历了多次更新和发展。现 今普遍使用的显微操作器一般由带荧光或相差 的倒置显微镜、显微操作臂、注射器及玻璃微 吸管、，摄像装置和计算机图像处理装置等组 成。为了配制一个性能优良的用于发育生物学 研究的显微操作系统，虽有许多必须考虑的因 素，但由于现在普遍采用的显微操作系统一般 都是配套购置，且都具有详细的说明书，因而 这里就不详述。有兴趣者还可参考有关文献。Development al Biology 二、显微注射步骤 1注射用卵母细胞的制备 在鱼类和两栖类动物中，卵母细胞可采用两种 方法获得，一是将动物麻醉后，通过解剖取出 卵巢叶(两栖动物)，或用挖卵器从泄殖孔取出 所需要的卵母细胞；另一种方法是杀死动物， 取出全部卵巢。对哺乳动物而言，一般通过超 数排卵(superovulation)获得更多的卵母细胞， 即模拟体内卵母细胞发育与排放的激素调节模 式，通过注射不同的促性腺激素，刺激暂时处 于休眠状态的卵母细胞进入成熟发育期，成熟 后排放到输卵管中。由此可以获得的卵母细胞 远多于自然排卵。下面以两栖动物爪蟾为例， 简要介绍制备卵母细胞的这两种方法的基本步 骤。De

3、velopment al Biology (1)取出完整卵巢及卵母细胞的培养 (2)取出卵巢叶及卵母细胞的培养 2注射用胚胎的制备 3.显微注射 在开始注射之前，应准备好所有试剂和 器具。Development al BiologyDevelopment al Biology第二节胚胎原位杂交 一全胚原位杂交 全胚原位杂交(whole mount insuite hybridization，WISH)是广泛用于胚胎发 育调控基因表达研究的一种技术。近年 来该技术发展较快，不仅可以检测到较 弱的杂交信号，而且可以多色杂交，检 测多个基因的表达情况。Development al Biology 全胚原位杂交的基本原理: 是用各种标记物标记与体内特定mRNA 互补的RNA分子(反义RNA)，以它们作 为探针与动物的整体胚胎进行原位杂交 ，然后用相应的抗体来检测特异探针的 分布情况。以下以爪蟾胚胎为例介绍全 胚原位杂交的操作步骤。其他动物的全 胚原位杂交与爪蟾基本相同。Development al Biology (一)单色全胚原位杂交 1原位杂交试剂 2操作步骤 (1)探针制备 (2)胚胎的

4、固定与保存 (3)原位杂交 (4)洗脱和检测 Development al Biology(二)双色全胚荧光原位杂交 用2种不同的标记物(DIG-11-dUTP，生 物素一11一dUTP等)分别标记2个探针， 同时与胚胎杂交，然后对两个探针分别 用相应的抗体进行检测。 在双色全胚原位杂交中，探针的制备、 胚胎的固定杂交及洗脱方法与单色原位 杂交步骤相同，只是检测方法有所不同 。两次加入不同的抗体进行两次显色。 Development al Biology二胚胎组织切片原位杂交 原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方 法。虽然全胚原位杂交简单易行，但在 许多情况下，该方法还达不到研究的要 求，因而需要在胚胎的组织切片上进行 杂交。在胚胎的组织切片上杂交的有利 因素在于不存在探针不能渗入到胚胎内 部的问题。Development al Biology第三节 胚胎免疫组织化学 技术 一用途：胚胎免疫组织化学是定 位胚胎内的内源或外源蛋白质的一 种有效方法。该技术操作相对简单 ，如果和其他一些免疫学技术结合 使用，可以快速获得相关蛋白质功 能的有关信息。 Development al Biolog

5、y 二胚胎免疫组织化学技术的基本原理 ： 是用某种蛋白质免疫其他动物(通常为鼠 或兔)而获得相应的抗体(初级抗体)，再 用初级抗体免疫另一种动物，获得次级 抗体。在次级抗体上偶联上一种酶(如碱 性磷酸化酶)，构成免疫复合物。将胚胎 与初级抗体结合后，洗去多余的抗体， 再与免疫复合物结合。最后利用显色反 应来确定胚胎内特定蛋白质的表达位置 。本节以爪蟾胚胎为例介绍胚胎蛋白质 免疫组织化学检测的操作方法。Development al Biology 三操作方法 1实验所需溶液 2爪蟾胚胎免疫组织化学检测 (1)胚胎固定 (2)漂白 (3)免疫检测 (4)胚胎切片 Development al Biology第四节发育基因的启动子分 析 一。用途 启动子调控作用分析是研究胚胎发育基 因功能的一种重要方法，特别在研究基 因时空表达的分子机制方面，更是有突 出的作用。通常，启动子分析包括基因 特异调控序列、启动子(promoter)和增强 子元件(enhancer element)的鉴别，它们都 是基因转录活性的重要调控单元。 Development al Biology 二。原理： 启动子分析

6、的第一步是将一系列大小不同的启 动子的片段克隆到含有报告基因(reporter gene) 的载体中，然后通过比较这一缺失系列中启动 子的活性，找到启动子中具有调控能力的序列 。随后，将被鉴定出来的调控序列分为更小的 片段，并亚克隆到含有异源活性启动子(如单纯 疱疹病毒胸苷激酶基因启动子)和报告基因的载 体中，再次比较缺失系列启动子的活性，以确 定调控序列中的最关键序列。最后，可通过野 生型启动子中单个碱基的点突变，进一步确定 基因的关键调控元件(图32)。Development al Biology 有多种方法可用于体内(in vivo)启动子分 析，如转基因动物、显微注射等，在不 同的动物中可选用不同的方法，但比较 而言，转基因动物法较为费时，而且需 要一些特殊条件，而显微注射法较为简 单。本节将以斑马鱼胚胎中goosecoid基 因启动子分析为例介绍启动子的定性和 定量分析方法。Development al BiologyDevelopment al Biology 1. 实验所需试剂 2分散囊胚细胞中的启动子分析 3完整胚胎中启动子的定量分析 4整体胚胎中启动子空间活性分析 D

7、evelopment al Biology第五节 基因表达的核糖核酸酶 保护分析 一 应用：核糖核酸酶(RNase)保护实验是 定量分析基因转录水平的常用方法之一 ，它对mRNA的分析具有灵敏度高(比 Northern杂交和点杂交灵敏810倍)、特 异性强的特点。另外，核糖核酸酶保护 实验还可用于转录起始位点的确定、内 含子外显子边界的确定、选择性剪接 (alternative splicing)分析及确定转入到胚 胎中的核酸的降解率等方面的研究。Development al Biology 核糖核酸酶保护实验的基本原理是： 将待分析的目标DNA序列作为模板，用 逆转录的方法合成与之互补的放射性标 记的探针。将此探针加入到RNA混合物 中后，它便可与目标RNA杂交，形成双 链RNA。由于该双链对核糖核酸酶具有 抵抗力，因此，杂交体系中未杂交的样 品RNA及过量的探针全部被核糖核酸 酶消化，只剩下杂交形成的双链RNA。 核糖核酸酶失活后，通过凝胶电泳和放 射自显影检测被保护的RNA探针的量， 即RNA样品中目标RNA的量。 Development al Biology 1实验用试剂 2操

8、作步骤 (1)胚胎总RNA提取 (2)RNA探针的合成和纯化 (3)杂交和RNA酶消化Development al BiologyDevelopment al Biology第六节 抑制性差减杂交技 术 一.应用： 抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)最早见于1996 年6月Clontech公司、加州大学旧金山分校和俄 罗斯科学院合作的研究报道(Diatchenko et a1 .996)，是一种简便而高效的通过比较两种总 mRNA，而克隆只存在于其中一种总mRNA中 特异表达产物的新方法。例如可以快速从不同 细胞系、不同组织间或同一细胞系、同一组织 在不同条件下(如发育时间的差异、病理性差异 等)克隆出差别表达基因。Development al Biology 二原理 是以抑制PCR为基础的DNA差减杂交。 抑制PCR是利用DNA链内退火优于链 间退火，比链间退火更稳定的特点，使 非目的系列片段两端反向重复系列在退 火时产生类似于“锅一柄”的结构，无法 与引物配对，选择性地抑制了非目的基 因片段的扩增。同时，该方法运用了

9、杂 交二级动力学原理，即高丰度的单链 cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快 于低丰度的单链cDNA，从而使原来在丰 度上有差别的单链cDNA相对含量达到基 本一致。 Development al Biology 三.SSH基本过程是： 抽提2种不同细胞如肿瘤细胞和正常细胞的mRNA分别 作为检测样本(tester)和参照样本(driver)，反转录成 cDNA，用Rsa I或Hae III酶切，以产生大小适当的 平头末端cDNA片段，将tester cDNA分成均等的2份， 各自接上2种接头，与过量的driver cDNA变性后退火 杂交。第一次杂交后有4种产物： (a)tester cDNA， (b)自身退火的tester cDNA双链，(c)是tester和driver的 异源双链，(d)是driver cDNA。第一次杂交的目的是实 现tester单链cDNA均等化(normalization)，即使原来有 丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致，由 于tester cDNA中与drivercDNA。序列相似的片段大都 和driver cDNA形成异源双链分子(c)，使tester cDNA 中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。第一次 杂交后，合并2份杂交产物，再加上新的变性driver单 链，再次退火杂交，此时，只有第一次杂交后经均等 化和扣除的单链tester cDNA和driver cDNA一起形成各 种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的 cDNA，产生了一种新的双链分子(e)，它的2个5端有2 个不同的接头，正由于这2个不同的接头，使其在以后 的PCR中被有效地扩增(图33)。 Development al BiologyDevelopment al BiologyDevelopment al Biology 操作过程 1实验中所需试剂 2实验步骤 （1）RNA的提取 （

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