6-3微生物培养法概论
45页1、第四节 微生物培养法概论微生物培养装置的基本条件:按微生物的生长规律进行科学设计;能提供丰富而均衡的营养物质;保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条 件(厌氧菌除外);提供一个适宜的理化条件;严防杂菌污染。 从少量培养发展到大规模培养; 从浅层培养发展到厚层(固体制曲)或深层(液体搅拌)培养; 从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主; 从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养; 从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养; 从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团;微生物培养技术的发展特点: 从单纯利用微生物细胞到利用动、植物细胞进行大规模培养; 从利用野生型菌种发展到利用变异株甚至遗传工程菌株; 从单菌发酵发展到混菌发酵; 从低密度培养发展到高密度培养(high cell-density culture,HCDC); 从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐等;微生物的培养方法可分为八个大类一、实验室培养法(一)固体培养法1.好氧菌的固体培养试管斜面(test-tube slant)培养皿琼脂平板(agar plate)克氏扁瓶(kolle flask
2、)茄子瓶(4)厌氧罐(anaerobic jar)(1)高层琼脂柱(2)厌氧培养皿(3)亨盖特滚管技术(hungate roll-tube technique)(5)厌氧手套箱(anaerobic glove box)厌氧菌固体培养的具体方法 2.厌氧菌的固体培养(1)高层琼脂柱把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中,经灭菌后,除表层上有一些溶解氧外,越是深层,其氧化还原势越低,故有利于厌氧菌的生长。例如,韦荣氏管(Veillon tube)是由一根长25cm、内径1cm,两端可用橡皮塞封闭的玻璃管,可作稀释、分离厌氧菌并对其进行菌落计数。(2)厌氧培养皿 利用特制皿盖去创造一个狭窄空间,加上还原性培养基的配合使用而达到厌氧培养的目的,例如,Brewer皿 利用特制皿底有两个相互隔开的空间,其一放焦性没食子酸,另一则放NaOH溶液,待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后,立即密闭之,经摇动,使两试剂接触而发生吸氧反应,从而造成无氧环境,例如,Spray皿或Bray皿(3)亨盖特滚管技术(hungate roll-tube technique)由著名美国微生物学家R.E.Hungate
3、于1950年分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌时设计的一种具有划时代意义的严格厌氧技术亨盖特滚管技术(Hungate roll-tube technique)。其主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮,并用高纯氮驱除小环境中的空气,使培养基的配制、分装、灭菌和贮存,以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下,从而保证了这类严格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预还原无氧灭菌培养基(PRAS培养基,pre-reducedanaerobicallysterilizedmedium)。在进行产甲烷菌等严格厌氧菌的分离时,可用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释,并接种到融化后的PRAS琼脂培养基中,然后将此试管(图7-13)用丁基橡胶塞严密塞住后平放,置冰浴中均匀滚动,使含菌培养基布满在试管的内表面上,犹如好氧菌在培养皿平板表面一样,最后长出许多单菌落(4)厌氧罐(anaerobic jar )这是一种常规的但不很严格的厌氧菌培养技术,原因是它除能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无氧环境外,无法使培养基配制、接种、观察、分离、保藏等操作也不接触氧气。对厌
4、氧罐反复抽真空、对厌氧罐反复抽真空、 灌氮气,最后灌混合灌氮气,最后灌混合 气体气体 N2:CO2:H2 80:10:10(V/V),剩剩 余氧在钯催化剂的催化余氧在钯催化剂的催化 下,与灌入混合气体中下,与灌入混合气体中 的氢气还原成水而除去,的氢气还原成水而除去, 从而形成良好的无氧环从而形成良好的无氧环 境。境。一般方法国际上盛行方便的“Gaspak”内源性产气袋方法方法:把“Gaspak”内源产气 袋剪去一角并注入适量水后投入 厌氧罐,并立即封闭罐盖,它就 会自动缓缓放出足够的CO2和H2 。“GasPak”内源性产气 袋 产H2反应: NaBH42H2O NaBO24H2硼氢化钠产CO2反应: 柠檬酸3NaHCO3 柠檬酸钠3CO23H2O 加水(国际上盛行方法)(5)厌氧手套箱(anaerobic glove box)箱内始终充满成分为N2:CO2:H285:5:10(V/V)的隋性气体,并有钯催化剂保证箱内处于高度无氧状态。通过塑料手套进行操作。 Anaerobic Glove Box大多数微生物都是好氧菌,微生物一般只能利用溶于水中的氧,要保证在培养液中始终有较高的溶解
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