《植物组织培养》课件第3章植物组织培养技术-灭菌方法、无菌操作技术
39页1、第三章 植物组织培养技术-灭 菌方法、无菌操作技术内容:灭菌无菌操作愈伤组织的分化与再分化、脱分化形态发生教学目的要求1掌握外植体的选择条件与消毒方法;2掌握外植体接种操作步骤及培养的环境 条件;3了解愈伤组织形成的条件及愈伤组织形成 过程、形态发生的调控方法,掌握愈伤组织 的形态发生方式和植物组织培养中愈伤组织 培养的基础技术。4一般掌握离体叶片和离体根培养基本过程 (选修);掌握离体茎培养的种类和操作步 骤;本节教学重点、难点:重点:无菌操作技术;组培苗的培养难点:无菌操作技术第一节 外植体的选择和消毒一、外植体的选择选取性状优良的种质或特殊的基因型 1.选择健壮的植株 : 健壮、无病虫 、发育正常代谢旺盛,再生能力强,培养后比较容易成功 2.选择最适的时期 :旺盛生长期注意植物的生长季节和生长发育阶段:茎尖、花蕾、嫩叶生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等,往往由于携菌量较多 ,不易消毒而难以培养成功。 3.选取适宜的大小 :一般0.5-1cm; 脱毒0.2-0.3mm材料太大易污染,也不需要;材料太小,易受 伤害胁迫、多 形成愈伤组织, 甚至难于成活 外植体(叶)的各个部分其芽、苗再
2、生能力也很不相同 胶皮枫香树(Liquidamnbar styraciflua “Variegata”)叶 片外植体的供体及叶的部位对其不定芽形成的影响外植体 部位每个外植体形成不定芽分生组织的数目由培养基上增 殖苗中的叶片由温室生长2年的完 整植株上的叶片叶 柄 叶 片 总 数6.7 8.0 14.76.7 50.3 57.0外植体培养于WPM附加0.1mg/L NAA和2.5mg/L BA的培养基中,实验用外 植体数为70二、灭菌与消毒(一)有菌和无菌的范畴有菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体 ,它的表面都是有菌的。无菌的范畴:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其 他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。菌类:细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点:极小,肉眼看不见;无处不有,适应能力强;繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。消毒:指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不 再发生危害作用的过程。(二)常用的灭菌与消毒方法灭菌方法: 物理方法:如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常 压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波 、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等 灭菌措施; 化学方法
3、:使用升汞、甲醛、过氧化氢、 高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、 抗菌素、酒精化学药品处理,以达灭菌效 果。1.湿热灭菌(培养基)高压灭菌的原理:在密闭的蒸锅内,其中的蒸气不能外 溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也 随之增加。在o1MPa的压力下,锅内温度达121。在此 蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。常用方法:关闭放气阀,通电后,待压力上升到O 05MPa时,关电源,打开放气阀,放出空气,待压力表指 针归零后,再关闭放气阀。关阀再通电后,压力表上升达到 01MPa开始计时,压力01-015MPa,20min。注意:1、培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。2、完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸 气,灭菌才能彻底。2.灼烧灭菌(用于无菌操作的器械 )镊子、剪子、解剖刀等: 浸入95%的酒精中 酒精灯火焰上灼烧灭菌 冷却后,立即使用。3.干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具)利用烘箱加热到160-180C的温度(持续 90min)来杀死微生物。 注意: 1、干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为 包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的 塑料
4、。 2、灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。 3、烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对 流和穿透; 4、到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱, 以免因骤冷而使器皿破裂。 缺点:干热灭菌能源消耗太大,浪费时间。 4.过滤灭菌(不耐热的物质 )对象:不耐热又不能用高压灭菌处理的 制剂。如:一些生长调节剂,如赤霉素 、玉米素、脱落酸和某些维生素等。滤膜网孔直径:0.45m以下,当溶液通 过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等 因大于滤膜直径而被阻。5.紫外线和熏蒸灭菌(空间)(1)紫外线灭菌 紫外线的波长为200300nm,其中以260nm的杀菌 能力最强,要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气 和物体表面的微生物。方法简便,空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂:高锰酸钾、甲醛。常用方法:房间关闭紧密,按58mlm3用量,将 甲醛置于广口容器中,加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸 时,房间可预先喷湿以加强效果。6.喷雾灭菌(物体表面)70%75%的酒精l%-2%的来苏儿溶液 涂擦、喷雾0.25%1%的新洁尔灭(桌面、墙面、双手
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