HPV DNA检测及质量保障和质量控制

1、HPV DNAHPV DNA检测及质量保障和质量控制检测及质量保障和质量控制 报告人：王庆勇 人乳头瘤病毒（人乳头瘤病毒（HPVHPV） HPV DNAHPV DNA检测检测 质量保障和质量控制质量保障和质量控制 宫颈癌是世界高发妇科肿瘤，宫颈癌是世界高发妇科肿瘤，85%发生于发展中国家。发生于发展中国家。 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒 The most frequent cancers in The most frequent cancers in wmenwmen worldwide (in thousands of new cases per year)worldwide (in thousands of new cases per year) 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒 人乳头瘤病毒（人乳头瘤病毒（HPV）是一类无包膜的小）是一类无包膜的小DNA病毒，它们可感染人的皮肤和病毒，它们可感染人的皮肤和 黏膜上皮组织，引起上皮组织的各种良恶性增生病变。黏膜上皮组织，引起上皮组织的各种良恶性增生病变。 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒 Percentage of invasive cervical

2、cancers attributable to specific HPV genotypesPercentage of invasive cervical cancers attributable to specific HPV genotypes A diagram of the life cycle of HPV in a mucosal A diagram of the life cycle of HPV in a mucosal squamoussquamous epitheliumepithelium 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒 2008年10月6日公布Harald zur Hausen获诺贝尔生 理学或医学奖。 在“诺奖”评审委员会发布的新闻公告中，这样写到：“拉尔德 楚尔 豪森敢于 摒弃教条，他所做出的探索性工作，让人类了解了HPV与宫颈癌的关系，促进了 针对HPV疫苗的开发”。 宫颈癌也由此可能成为人类通过注射疫苗、筛查和早诊 早治来预防，并被消除的第一个恶性肿瘤。 宫颈癌成为目前癌症中： 唯一病因明确 唯一可以早期预防和治疗 唯一可以彻底根除的癌症 HPV的生长具有严格

3、的种属与组织特异性，不能体外培养。的生长具有严格的种属与组织特异性，不能体外培养。 减毒活疫苗减毒活疫苗 L1 L2 原核表达的原核表达的L1蛋白免疫后诱导产生的抗血清蛋白免疫后诱导产生的抗血清 中和能力较弱，免疫保护力较弱。中和能力较弱，免疫保护力较弱。 L1 VLPs L1/L2 VLPs L1 L1 L2 + 真核 表达 L1单独存在或与单独存在或与L2一起均可以组装成病毒样颗粒（一起均可以组装成病毒样颗粒（VLP），）， 其形态和免疫原性都与天然病毒类似，但不含病毒基因组其形态和免疫原性都与天然病毒类似，但不含病毒基因组DNA。 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒 目前已有的VLP疫苗： HPV16，18，6，11 VLP HPV 16，18 VLP 均含均含HPV 16HPV 16，- -1818 两种高危型两种高危型 安全性、免疫保护活性都很好，检测终点是安全性、免疫保护活性都很好，检测终点是HPVHPV感染及感染相关的癌前病变。感染及感染相关的癌前病变。 免疫保护反应主要是型别特异性的，交叉保护效果不理想免疫保护反应主要是型别特异性的，交叉保护效果不理想(HPV(HPV型别地理位置

4、差异型别地理位置差异) )。 HPVHPV- -4545型在来自非洲西部宫颈癌组织中很常见型在来自非洲西部宫颈癌组织中很常见 HPVHPV- -5252、5858型在中国妇女中检测率较高型在中国妇女中检测率较高 DNADNA疫苗疫苗 重组病毒疫苗重组病毒疫苗 蛋白疫苗蛋白疫苗 肽疫苗肽疫苗 HPVHPV治疗治疗 性性疫苗疫苗 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒 病毒主要转化基因的持续高水平表达是肿瘤细胞恶性表型维持所必需病毒主要转化基因的持续高水平表达是肿瘤细胞恶性表型维持所必需 增强策略：改造抗原基因、协同佐剂、融合免疫活性分子增强策略：改造抗原基因、协同佐剂、融合免疫活性分子 人乳头瘤病毒（人乳头瘤病毒（HPVHPV） HPV DNAHPV DNA检测检测 质量保障和质量控制质量保障和质量控制 （聚合酶链反应的发明） 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不 耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后

5、PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环 仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 HPV DNAHPV DNA检测检测 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温 度（） PCR的基本原理 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复13步 2530轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变 性形 成2条 单 链子链延伸 DNA加倍 HPV DNAHPV DNA检测检测 PCR的特点 灵敏度高 1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4.细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织 等组织的粗提DNA HPV DNAHPV DNA检测检测 HPV DNAHPV DNA检测检测 Summary of common commercially available nucl

6、eic acid tests for the Summary of common commercially available nucleic acid tests for the detection of HPV in cervical sample of women (not comprehensive)detection of HPV in cervical sample of women (not comprehensive) HPV DNAHPV DNA检测检测 Summary of common commercially available nucleic acid tests for the Summary of common commercially available nucleic acid tests for the detection of HPV in cervical sample of women (not comprehensive)detection of HPV in cervical sample of women (not comprehensi

7、ve) HPV DNAHPV DNA检测检测 HRHR- -HPVHPV持续感染导致宫颈浸润癌的发生。持续感染导致宫颈浸润癌的发生。 HRHR- -HPVHPV感染很普遍，大部分为一过性感染，可自动消除。感染很普遍，大部分为一过性感染，可自动消除。 HRHR- -HPVHPV筛查具有高度的灵敏度。筛查具有高度的灵敏度。 HRHR- -HPVHPV检测进行初筛特异性（检出的非致瘤病变所导致的阴道镜过度检测进行初筛特异性（检出的非致瘤病变所导致的阴道镜过度 转诊和过度治疗）转诊和过度治疗） 没有哪一种癌症筛查检测方法能够检出所有已发或早期宫颈癌病例。没有哪一种癌症筛查检测方法能够检出所有已发或早期宫颈癌病例。 HPV DNAHPV DNA检测检测 相对于细胞学检查阴性，相对于细胞学检查阴性，HrHPV检测阴性更确保发生检测阴性更确保发生CIN3+的风险更低。的风险更低。 另外，另外，ATHENAATHENA研究显示，研究显示， HrHPV初筛相比细胞学可多检出初筛相比细胞学可多检出50%50%的的CIN3+ CIN3+ HPV DNA检测检测 2015 ASCCP过渡期筛查指南 合理管理合

8、理管理hrHPV阳性女性的方法是：对阳性女性的方法是：对hrHPV阳性者采用阳性者采用HPV16和和HPV18基因基因 分型，并结合细胞学对其它分型，并结合细胞学对其它12种种hrHPV阳性分流。阳性分流。 HPV DNA检测检测 HPV DNA检测检测 HPVHPV检测对于宫颈高级别病变具有高度的敏感性和特异性检测对于宫颈高级别病变具有高度的敏感性和特异性 HPVHPV检测操作简单，结果快速，成本效益评价优检测操作简单，结果快速，成本效益评价优 检测方法具有临床验证检测方法具有临床验证 敏感度可达敏感度可达85%85%，阴性预测值达，阴性预测值达90%90%以上以上 HPV DNAHPV DNA检测检测 人乳头瘤病毒（人乳头瘤病毒（HPVHPV） HPV DNAHPV DNA检测检测 质量保障和质量控制质量保障和质量控制 设备要求设备要求 人员要求人员要求 环境要求环境要求 质量控制要求质量控制要求 数据采集要求数据采集要求 质量保障和质量控制质量保障和质量控制 设备要求设备要求 实验室应当具备与检测要求相适宜的仪器设备（包括：检实验室应当具备与检测要求相适宜的仪器设备（包括：检 测

9、仪器、试剂及测仪器、试剂及耗材耗材） 同时应遵守实验室制定的标准操作规程同时应遵守实验室制定的标准操作规程 （SOPSOP）和临床基）和临床基 因扩增实验室管理要求。因扩增实验室管理要求。 质量保障和质量控制质量保障和质量控制 实验室使用的分析仪器和主要的辅助设备、试剂应有国家食品药品管理实验室使用的分析仪器和主要的辅助设备、试剂应有国家食品药品管理 局批准和注册的文件局批准和注册的文件。 应制定相应的维护和功能检查程序文件，按照厂家要求或实验室建立的应制定相应的维护和功能检查程序文件，按照厂家要求或实验室建立的 方案定期进行校准及维护，并做相应记录。方案定期进行校准及维护，并做相应记录。 设备及试剂的要求设备及试剂的要求 质量保障和质量控制质量保障和质量控制 光源 样品 检测器 发射滤 光片 激发滤光片 标本采集容器应采用一次性或无菌容器标本采集容器应采用一次性或无菌容器, ,保存液符合要求。保存液符合要求。 实验室在选择试剂时要进行验证实验室在选择试剂时要进行验证（说明书上的性能指标说明书上的性能指标） 使用不同批号试剂要做平行检测使用不同批号试剂要做平行检测, ,保证每一批试剂的有效性保证每一批试剂的有效性。 设备及试剂的要求设备及试剂的要求 质量保障和质量控制质量保障和质量控制 临床灵敏度：临床灵敏度： 真正把高度病变的妇女筛出，而不是把病毒检出。真正把高度病变的妇女筛出，而不是把病毒检出。 分析灵敏度：分析灵敏度： 灵敏度高可减少漏诊，但假阳性（发现过多无临床意义或无风险的灵敏度高可减少漏诊，但假阳性（发现过多无临床意义或无风险的HPVHPV阳阳 性妇女）会增多，增加检查费用和不必要的阴道镜和病理检查。性妇女）会增多，增加检查费用

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