药敏试验(扩散法)操作方法34页

1、药敏试验（扩散法）操作方法内容:一、药物敏感试验的目的与意义二、常用的药敏测定方法 三、试验准备及用品四、药敏试验操作步骤五、结果观察六、影响药敏结果的因素一、概念抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：用于测 试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。 （1）MIC：体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度，临 床医师可以根据MIC确定药物剂量。通常达到稳态的血 药峰浓度（Css）max应为MIC的4-8倍，重症感染以大于 8倍为妥。 （2）为方便临床给药，根据MIC提供一个定性的结果是 必要的。临床医师根据敏感、中介、耐药的提示结合 MIC可以方便地制定用药方案。 敏感（S）：表示该药物对细菌的MIC值低于常规剂量下的抗菌 药物血液浓 度或组织浓度4-8倍，可以用常规剂量治愈。 中介（I）：表示该药物对细菌的MIC值接近于常规剂量给药后的血药浓度 或组织药物浓度，细菌对该药的敏感性降低，但仍可用于生理性浓集部位的 感染或使用高剂量药物进行治疗（注：必须考虑高剂量的安全性）。 耐药（R）：表示该药物对细菌的MIC值等于或高于常规剂量下药物的血液 浓度或组织浓度，细菌不能被该种药物抑制。

2、意义：1、检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理 用药。避免盲目用药、滥用药、大剂量用药。2、监测耐药性，分析耐药菌变迁，了解某一地区致病 菌的耐药变迁、流行病学调查及监控，控制和预防耐药 菌株的流行3、为经验用药提供所选药物的参考依据，可预测抗菌 治疗的效果。“敏感”治疗可能有效；“耐药” 肯定 失败4、新抗菌药的研究以下情况不需进行药敏测定：标本污染细菌，非致病菌引起已知某些抗菌药对某菌有良好的抗菌作用且很少 有耐药菌产生已知细菌全部耐药的药物对营养要求高而不易生长的细菌二、常用的药敏测定方法 1、扩散法：纸片法、牛津杯法、打孔法等。纸片法 手工测试的方法，通过测试药物纸片在固体培养基 上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。目前临床上 广泛使用此法。定性 2、稀释法：琼脂稀释法、液体稀释法（试管、微量）通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断 其最低抑菌浓度（MIC）。自动化仪器均采用液体稀释法为药敏 试验的方法。 定量 3、E测定法（E test）：与扩散法相似，但药物包被于长塑料条上，能够精确测定 MIC值。适于一些特殊病原菌的药敏测试，但价格较为昂贵

3、。 4、全自动药敏仪法：三、试验准备及用品药品（单品药、药厂的成品药、中药）、恒温培养箱、药敏片、 培养基、平皿（直径90mm）、烧杯、蒸馏水、滤纸、打孔器（文 具店有售）、0.5麦氏比浊管配制方法：0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2.2H2O) 0.5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效 期为6个月。1、培养基MH肉汤（MHB）Mueller-Hinton Broth用途：用于抗生素敏感试验配方：（g/L）牛肉粉2.0 可溶性淀粉1.5 酸水解酪蛋白17.5pH值 7.4 0.2 25 原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提 供氮源、维生素和氨基酸；可溶 性淀粉吸收有毒的代谢产物。用法：称取本品21.0g,加热溶解 于1000ml 蒸馏水中,121高压灭 菌15分钟,备用。MH琼脂（MHA） Mueller-Hinton Agar 用途：用于抗生素敏感试验 配方：（g/L） 牛肉粉6.0 可溶性淀粉1.5 酸水解酪蛋白17.5 琼脂17 PH值 7.3 0.1 25 原理：牛肉粉和酸水解

4、酪蛋白提供氮源 、维生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有 毒的代谢产物；琼脂是培养基的凝固剂 。用法：称取本品 42.0g,加热溶解于 1000ml蒸馏水中,121高压灭菌15分钟, 待冷至 50，倾入无菌平皿,备用。1、是兼 性厌氧菌 和需氧菌 药敏试验 标准培养 基 2、如营 养要求高 可加0.5% 羊血。 3、平板 直径为 9cm。 4、琼脂 板厚度 4mm。误 差1mm 。 5、4 保存7天 。营养肉汤（NB） Nutrient Broth用途：一般细菌培养,转种,复壮, 增菌等（GB标准） 配方：（g/L）蛋白胨10牛肉粉3氯化钠5pH值7.2 0.2 25 原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮 源、维生素、氨基酸和碳源；氯 化钠能维持均衡的渗透压。用法：称取本品18.0g,加热溶解 于1000ml蒸馏水中,分装三角瓶或 管, 121高压灭菌15分钟备用 。营养琼脂（NA） Nutrient Agar用途：一般细菌培养,转种,复壮,增 菌等（GB标准） 配方：（g/L）蛋白胨10肉浸粉10氯化钠 5琼脂20pH值7.2 0.2 25 原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源 、维生素、氨基酸和碳源；

5、氯化钠 能维持均衡的渗透压。用法：称取本品18.0g,加热溶解于 1000ml蒸馏水中,分装三角瓶或试管 ,121高压灭菌15分钟备用。MH肉汤（ 100）、 MH琼脂（ 250） ；营 养肉汤（ 60） 、营 养琼脂 （80）均 可以生化试 剂店买到。操作步骤：1、玻璃器皿的准备冲洗、包裹、灭菌、干燥2、记量、称取原料3、加热溶解4、校正PH值5、灭菌6、分装、包裹、备 用2、药敏片1、单药（一种成分） 市场生化 试剂店有售，也可自制。但含量及 监测标准有严格界定。建议购买2、成药（复方成分） 多种联合 的抗菌药物制剂应以其成分中某种 含量最高的抗菌药物为标准稀释成 有效浓度。但多数厂家由于产品配 方机密，多按产品用量进行配制。 药敏片可由厂家提供，也可自制。3、中药草药 将中药研成粉未， 1克加适量的水充分浸泡煮沸,滤液 除去杂质后浓缩成1毫升,过滤、高 压灭菌后加入100张纸片干燥备用 。制作步骤：1、纸片的准备2、药液的配制3、抗菌药敏纸片制作质控：标准菌株的抑菌 圈直径应落在预期范围 内，如果超出该范围， 应视为失控而予以纠正 。简易药敏片的制法纸片的准备：1、取新华1号定性

6、滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆 形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中 ，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒 后，放在37温箱或烘箱中数天，使完全干燥。2、药片吸水量的测定 在上述药片用微量移液器进行滴 加蒸馏水，最可使药片完全浸透又不滴水为宜，最终计 算出每片药片的吸水量。一般常用直经6mm的定性滤纸 药片吸水量为0.01ml。药液的制备（用于商品药的试验）： 按兽药说明书(或标签)上标明的治疗量的10-20倍比例配制药液 。如某药品：100g兑水100kg，表明该药治疗量为1g兑水1L，配 制药液时就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g药品，即为配制药 敏片所用的药液浓度。 抗菌药的稀释剂通常用纯化水。说明： 不同厂家标示成分及含量相同的成品制剂在用成品做成药敏时常出现显著差 异（包括同一厂家生产） 由于在进行成品制作时常加入一定量的辅助成份，其对药敏试验结果常造成 较大影响，所以成品药敏试验结果并不能完全显示成品的真实结果。 不能用单药的药敏结果代替成药进行用药。（标示与真实成份及含量有很大 差别） 建议选用厂家提供的以成品主药成份制作

7、的药敏片使用。 中药由于其成份复杂及独特作用机理，药敏试验不能作为唯一的判定标准。抗菌药敏纸片制作： 方法一:按每张纸片饱和吸水量为0.01毫升计，在上述含有50片纸片 的青霉素瓶内加入药液0.5毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸 透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名 称，放37温箱内过夜，干燥后即密盖。 方法二：1、将药液盛于干净干燥的平皿中。然后将烘干的纸片逐片放 入配制好的药液中，置于4-8浸泡1-2小时，同时要注意翻动， 使各纸片充分透药液。2、将浸泡好的药敏片用镊子夹出，放入另一干燥平皿中。置 于恒温箱中，温度37，烘干1224小时。（注意经常翻动，避 免药敏片重叠粘连）。3、将烘干好的药敏片放入青霉素瓶内进行保存。药敏纸片的储存：长期储存应于20，日常使 用的小量纸片可放在4，但 应至于含干燥剂的密封容器内 。使用时从低温取出后,放置 平衡到室温后才可打开，用完 后应立即将纸片放回冰箱内的 密封容器内。 过期纸片不能 使用, 应弃去。3、高压灭菌锅及使用4、其他用品四、药敏试验操作步骤：一步法：用病料直接在平板上进行涂抹后贴药敏 片，培养后观察。二步法：先

8、进行细菌的增值培养后，再取培养菌 进行平板药敏试验。（纸片法、牛津杯法、打孔 法）细菌增值培养：1、剖检已死亡或 即将死亡的家禽 。 2、以无菌手术镊 子陆续取出病料 （心，肝，肺， 脾均可）。 3、在酒精灯上把 手术刀，镊子， 接种环灭菌，再 用接种环采取病 料划在备好的培 养基上，划线要 均匀。（也可用 MHB肉汤或营养肉 汤上进行增菌培 养，摇床培养一 般约需6-8h）1、纸片琼脂扩散法（1/3）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。 原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平 板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围 扩散形成递减的梯度浓度,在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的 生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测 试菌的MIC呈负相关关系。1、纸片琼脂扩散法（2/3）1、细菌涂抹平板在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细 菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿

9、边缘相对四点涂 菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线 至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭 菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均 匀致密。） 2、贴药片：将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基 表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏 片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平 皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片 （外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。1、纸片琼脂扩散法（3/3）3、培养观 察将平 皿培养基 置于37 温箱中倒 置培养24 小时后， 观察效果 2、牛津杯法 第一步同“纸片法”细菌涂抹平板。以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、 高10 nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管 、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基 接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板 可放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定 数量的各种药液，勿使其外溢。置37培养8-18小时，观察结果。 3、打孔法：第一步同“纸片法”细菌涂抹平板。以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径 与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、 瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头 挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（ 以防药液渗漏，影响结果）。加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。将平皿培养基置于37温箱中培养24小时后，观察效果 。五、结果观察：在涂有细菌的琼脂平板 上，抗菌药物在琼脂内 向四周扩散，其浓度呈 梯度递减，因此在纸片 周围一定距离内的细菌 生长受到抑制。培养一 定时间后形成一个抑菌 圈，抑菌圈越大，说明 该菌对此药敏感性越大 ，反之越小，若无抑菌 圈，则说明该菌对此药 具有耐药性。其直径大 小与药物浓度、划线细 菌浓度有直接关系。联合药敏试验抑菌圈

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