cFLIP反义寡核苷酸纳米粒抑制人眼眶横纹肌肉瘤的体内实验研究

1、第二军医大学硕士学位论文c-FLIP反义寡核苷酸纳米粒抑制人眼眶横纹肌肉瘤的体内实验 研究姓名：梁莉申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：魏锐利20060401c - F L I P 反义寡核苷酸纳米粒对人眼眶横纹肌肉瘤裸鼠体内移植瘤模型的抑制作用【摘要目的探讨C F L 口反义寡核苷酸( c F L I P A S O D N ) 对裸鼠体内人I 艮I I i 横纹肌肉瘤移植瘤中c F L 口的表达和对肿瘤生长的作用。方法皮下种植法建立裸鼠人I I I i i横纹肌肉瘤动物模型，瘤体内分别注射e F L I P 反义寡核苷酸纳米粒( A S O D NN P ) 、未包裹的c F L I P 反义寡核苷酸( A S O D N ) 及生理盐水( N S ) 对照，通过一系列体内实验观察C F L I PA S O D N 纳米粒对眼眶横纹肌肉瘤的治疗功效并评价其安全性。结果与其他两组相比，A S O D NN P 组肿瘤的生长明显受到抑制( P O 0 5 ) 动物状态良好，实验期间无死亡( 图2 ) ，各组肿瘤体积见表1 。图2 裸鼠人眼眶横纹肌肉瘤模型表1 各组肿瘤体积( 又S

2、 ) ( m m 3 )时间( 天)细胞接种组组织块接种组0 d2 7 0 0 6 5 52 7 0 0 6 8 43 d5 2 4 0 1 6 7 54 0 3 0 2 1 5 27 d7 5 4 0 2 1 7 17 4 0 0 2 2 5 61 1 d1 2 9 4 4 8 1 21 2 9 3 0 5 0 3 51 4 d1 6 7 8 0 5 5 3 82 1 2 O O 5 7 9 11 7 d1 8 7 1 5 2 1 12 5 6 0 0 6 7 0 22 1 d3 4 2 8 6 8 6 55 1 0 0 0 8 1 7 02 4 d9 7 1 6 1 3 6 4 51 2 1 0 9 0 1 7 8 3 6第二军医大学硕士学位论文第一部分3 肿瘤生长曲线( 图3 ) ：从两组动物的肿瘤生长曲线可以看出，各组肿瘤生长趋势相近，均呈进行性生长，生长速度快，两组间肿痛体积无明显差别( P O 0 5 ) 。( 图3 )图3 两组肿瘤生长曲线图4 三组皮下剥出的肿瘤近球状，表面光滑可见丰富的血管及少量纤维组织增生，表面及切面色白，质较硬。镜检可见毛细血管以及肿瘤细胞分布密集

3、，呈腺样生长，细胞核大、深染，有异型，核仁1 6 个，核分裂相多见，与人眼眶横纹肌肉瘤标本病理切片H E 染色镜下所见相似。( 图4 ，5 )图4 肿瘤大体标本第二军医大学硕士学位论文第部分图5 H E 染色1 0 0讨论为了更好地了解c F L I P 反义寡核苷酸在体内的作用机制以及是否对肿瘤的生| 丈起抑制作用，需要建立合适的动物模型。裸小鼠与人类在遗传学、病理学、生物学许多特性方面相似，同时它因缺乏胸腺或仅有残遗的胸腺器官存在，缺乏成熟T 细胞的辅助抑制及杀伤功能，细胞免疫力低下，是肿瘤研究的理想动物模型。肿瘤模型按照建立方法可分为：自发和诱发小鼠模型；异种移植模型；转摹因小鼠模犁；基凼敲除小鼠模型；可调变的小鼠肿痛模型。本研究中我们采用异种移植模型，即将人类肿瘤移植在裸小鼠身上使其生睦发育。人横纹肌肉瘤( r h a b d o m y o s a r c o m a ，R M S ) 是一种分化程度不同的横纹肌母细胞所构成的高度恶性肿瘤，在人体很多部位发生，发病率较高。根据主要细胞成分可分为不同类型：胚胎型( e m b r y o n a l ) 、腺泡型( a l v

4、e o l a r ) ；和多形性( p l e o m o r p h i e ) ，3 m 眼眶内横纹肌肉瘤属于胚胎型”_ 3J 。蚍往研究表明用已建株的肿瘤细胞系移植裸小鼠成功率高于人肿瘤手术标本，同时使用已建株的肿痛细胞系还具有实验对比性好、反复复制的优点。因此实验前期我们选用了人胚胎型横纹肌肉瘤细胞株R D 的细胞悬液对B A L B c 裸小鼠进行接种。但实验发现成瘤率较低( 6 0 ) 、肿瘤发生潜伏期长( 接种后1 0 周以上) 。之后我们采用c o 对裸小鼠进行照剿，人为地进一步抑制裸小鼠免疫功能”。本研究结果显示经过“c o 照射后的裸小鼠进行细胞接种后的确缩短了肿痛发生的潜伏期f 接种后6 8 周1 ，同时成瘤率达 0 1 0 0 。经过”c o 照射后的裸小鼠进行细胞接种虽然缩短了肿瘤发生的潜伏期，但成瘤时裸鼠已为l o 周龄以上成年裸鼠，研究表明成年裸小鼠体内有较高的帐细胞活第二军医大学硕士学位论文第一部分力和不依赖T 细胞的效应机制【1 1 ，可能影响实验的结果。因此，我们继续取出已成瘤的瘤块采用组织块接种法，接种于新的一批4 周龄的B A L B c 裸小

5、鼠的胁部皮下，也获得1 0 0 成瘤率，同时缩短了成瘤时间。新的一批裸小鼠预先没有进行6 0 C o 照射，成瘤效果良好，考虑为经过体内培养后，提高了肿瘤细胞的适应体内环境的能力以及增加有活力的肿瘤细胞的数量的结果。在移植部位的选择上目前除了通常的皮下、肌肉内、腹腔内、脑内、肾囊膜下之外，还有常位异种移植( o r t h o t o p i ch e t e r o t r a n s p l a n t a t i o n ) 【l 】，即将人肿瘤细胞移植至与肿瘤原发部位相对应的裸鼠脏器内，其移植瘤的生物学行为和药物动力学特点更接近人类的原发瘤，但操作相对复杂，同时不利于观察肿瘤。本研究中移植部位选用动物的胁部皮下，胁部皮下生长空间大，利于肿瘤生长，便于药物应用后的疗效观察，适应下一步研究的要求。如有可能，我们也将进一步研究将人眼眶横纹肌肉瘤细胞或组织块移植入合适的动物眼眶内的制模和观察的方法。综上所述，裸小鼠异种肿瘤移植成功是指肿瘤增大，病理学证实，可传至别的裸鼠至少一次，我们应用细胞接种6 0 C o 照射后的裸小鼠以及结合皮下组织块接种法接种裸小鼠形成人眼眶横纹肌肉瘤的动物模

6、型成瘤率高，移植瘤生长良好，适于观察和研究，病理检查与人眼眶横纹肌肉瘤标本所见相似，为下一步对人眼眶横纹肌肉瘤的研究奠定了基础。参考文献1 朱清华，祝庆蕃。实验动物学。广州高等教育出版社，1 9 9 1 ：1 4 1 1 4 2 ，1 4 6 1 5 4 。2 倪连，马小葵，郭秉宽。1 4 2 2 例眼眶肿瘤的病理分类。中华眼科杂志，1 9 9 1 ，2 7 7 1 。3 S o n gG u o X i a n g O r b i t a ll e s i o n s ：e n l i g h t e n m e n tf r o m1 0 1 2o p e r a t i o n s A s i a nH o s p i t a l ，1 9 8 9 ，( 8 ) ：2 3 第二军医大学硕士学位论文第二部分第二部分c F L I P 反义寡核苷酸纳米粒抑制人眼眶横纹肌肉瘤的体内实验研究通过我们实验室对c - F L I P 反义寡核苷酸纳米粒治疗人眼眶横纹肌肉瘤的体外实验研究表明：c F L I P 在R D 细胞株、眼眶横纹肌肉瘤标本及周围正常组织中不同程度表达，在肿瘤中的表达水

7、平明显高于正常细胞。过度表达c F L I P 是肿瘤的一种特有现象，是横纹肌肉瘤细胞逃避死亡受体介导的凋亡的原因之一；采用二次超声乳化和溶剂挥发技术制备的c F L I P A S O D N 纳米粒子可有效抑制R D 细胞的c - F L I P 表达，逆转并恢复R D 细胞对F a s 诱导的凋亡敏感性，! 从而达到抑制肿瘤生长的目的。为了进一步观察应用c F L I P 反义寡核苷酸纳米粒后肿瘤细胞中c F L I P 的表达情况以及对实体瘤的确切治疗效果，我们采用B A L B c裸鼠建立了人眼眶横纹肌肉瘤的移植瘤模型，给予c F L I P 反义寡核苷酸纳米粒生理盐水溶液瘤体内注射的治疗，观察裸鼠的生存状态及其对移植瘤的疗效，并以制作组织芯片、病理切片H E 染色、荧光定量P C R 、W e s t e r n 蛋白印迹、免疫组化、原位细胞凋亡检测等主要手段来观察肿瘤组织的病理变化和c F L I P 基因的表达情况。对c F L I P 反义寡核苷酸纳米粒的抗肿瘤机制作了进一步的探讨。材料和方法一、材料1 主要试剂焦碳酸二乙酯( D E P C )氯仿异丙醇琼脂糖、溴化

8、乙锭1 0 m l ：9 0 m g 氯化钠注射液( N S )1 0 福尔马林液环氧树脂E p o n 8 1 2 包埋剂S i g m a 公司上海振兴化学试剂一厂上海振兴化学试剂一厂S a n g o n 公司上海旭东海普药液公司上海化学试剂有限公司上海化学试剂有限公司第二军医大学硕士学位论文第二部分原位细胞凋亡检测试剂盒鼠抗人c F L I P 蛋白多克隆抗体即用型E n V i s i o n 试剂细胞裂解液T r i z o l 试剂盒R I P A 蛋白质裂解液P M S F 液B - a c t i n ( S C 2 1 6 1 6 )3 3 一二氨基联苯胺盐酸盐M a s t e rM i x反转录酶2 实验动物模型大连宝生物工程有限公司S A N T AC R U Z 公司D a K o 公司P i e r c e 公司I n v i t r o g e n 公司申能博彩生物科技有限公司申能博彩生物科技有限公司S A N T AC R U Z 公司D A B 公司A B 公司T o Y o B a 公司由论文第一部分制备所得的裸鼠人眼眶横纹肌肉瘤模型。3 c -

9、F L I P 反义寡核苷酸( A S O D N ) ：序列为：57 一A C TT G T C C CT G CT C C T T G从一3 D - a ，M r = 60 0 0 ，下划线部分为硫代修饰提高其稳定性。由赛百胜生物技术有限公司合成。4 c F L I P 反义寡核苷酸纳米粒( A S O D NN P ) 冻干粉：由我实验室前期制备所得。5 荧光定量P C R 引物：参见文献H 1 ，按照引物设计原则设计上下游引物，由上海申公科技有限公司合成。c F L I P 。：上游引物：5 _ G C AG T C T C A C A GC T CA C CA T C - 3 ，下游引物：5 - T A CA G GT G TG A GC C AC T AC G C 一3 ；扩增产物：2 3 9 b p ；c - F I L P s ：上游引物：5 - T A TT C AA G GA G CA G GG A CA A G 一3 ，下游引物：5 - G A TC A G G A CA A TG G GC A TA G G - 3 ，扩增片断：11 6 b p ；内参G A P D H ：上游引物：5 一G A AG G TG A AG G TC G GA G TC - 3 ，下游引物：5 _ G A AG A TG G TG A TG G GA T TT C 一3 ，扩增片断：2 2 6 b p 。二、主要仪器设备0 2 2um 微孑L 滤膜美国H L T 公司冻存管丹麦N U N C 公司T i p s 和e p p e n d o r f 管玻璃匀浆器2 4上海安亭科学仪器有限公司上海安亭科学仪器有限公司第二军医大学硕士学位论文第二部分游标卡尺上海医用精密仪器厂小动物实验器械上海医用精密仪器厂C R Y 0 4 0 0 0 液氮罐四川亚西机器厂分析天平上海天平仪器厂X w 一8 0 A 旋涡混合器上海琪特分析仪器公司A G2 2 3 3 1H a m b u r g 紫外分光光度计E p p

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