鸡传染性支气管炎病毒广东分离株s1基因的克隆与序列分析
9页1、鸡传染性支气管炎病毒广东分离株 S1基因的克隆与序列分析 卢秀娴 张思远 叶贺佳 梅廷媛 广州市华南农大生物药品有限公司 鸡传染性支气管炎 (infectious bronchitis, IB) 是由鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis virus) 引起的一种急性、高度接触性传染病, 主要影响呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统等。各种日龄的鸡都会感染 IBV, 主要引起呼吸困难、肾炎、产蛋量和蛋品质的下降, IBV 还可侵害肾脏、肠道、腺胃、肌肉等组织, 给养禽业带来经济上的损失。IBV 自身有结构特殊性, 并且 RNA 聚合酶具有不完善的纠错机制能力, 使得病毒基因组在复制的过程易突变和重组频率增高, 能够产生许多血清型, 目前已报道的血清型已有 30 多种, 在我国主要以 Mass, T, Gray 和 Holte 株等为主。IBV 基因组为线性单股正链 RNA, 全长约 27.6 kb, 编码小膜蛋白 (E) 、膜蛋白 (M) 、核衣壳蛋白 (N) 和纤突蛋白 (S) 4 种主要结构蛋白。当 S 蛋白与宿主细胞膜上的病毒受体结合, 并通过宿主细胞的蛋
2、白酶裂解到 S1 和 S2 时, 病毒包膜可与细胞膜结合, 病毒纤突能表现出较强的特异性, S1 基因是诱导和选择性接受中和抗体的特异位点。S1 可刺激中和和血凝抑制抗体, 只有 S1 蛋白能诱导中和抗体, 使机体起到有效地保护。虽然 IBV 的遗传变异可以在基因组中的任何部分发生, 但主要集中在病毒的 S1 基因。S1 蛋白是主要的感染性和致病性的病毒蛋白, 其结构差异性导致了血清型的差异及变异株的存在, 并且与 IBV 抗原性漂变和致病性的改变有关, 并且还可以决定 IBV 血清型特异性抗原决定簇。S1 蛋白的氨基酸序列之间的差异性有可能改变毒株之间的血清型, 导致新的变异株出现, 使其抗原性或免疫原性的改变。本研究于 2017 年 5 月份在广东省某疑似患鸡传染性支气管炎的鸡场病料被分离到 1 株 IBV, 并对 IBV 分离株 S1 基因进行克隆、测序和序列基因遗传变异分析。一、材料与方法1. 病料来源、SPF 鸡胚及主要的试剂病料样品为 2017 年 5 月广东某鸡场疑似感染 IBV 鸡的气管、心脏、肝脏、肾脏等样品;10 日龄 SPF 鸡胚购自梅里亚实验动物中心;11 日龄
3、 SPF 鸡胚购自梅里亚实验动物中心;RNA 提取试剂盒购自 Ta Ka Ra 公司、DL2000 DNA Marker 均购自北京全式金公司;2XPhanta PCR Master Mix 购自诺唯赞生物公司;反转录试剂盒和核酸染料均购自 TIANGEN 公司, p MD20-T 载体购自 Ta Ka Ra 公司2. 引物设计与合成根据 Genbank 中公布的 IBV S1 基因组序列, 利用 Primer premier 6.0 软件及oligo6.0, 针对 IBV 基因组 S1 基因的保守基因区间设计 1 对特异性检测引物IBS1 (上游) :5-TTCAGGTGGCGTTGATAC-3 (下游) :5-AACCTTGGCCTACTCTGC-3;根据 S1 基因两端外的保守序列设计 1 对扩增 S1 全长基因的引物, 引物的理论跨幅为 1722bp, 可将 S1 基因片段完全覆盖, 引物序列:S1P1 (上游) :5-TTGAAAACTGAACAAAAGA-3, S1P2 (下游) :5-CCATAACTAACATAAGGGCA-3。由英潍捷基贸易有限公司合成引物。3. 病毒
4、分离采集临床病料 (主要是气管肝脏、肾脏等组织) , 研碎后加入适量 PBS, 在-20和常温条件下反复冻融 3 次, 8000 r/min 离心 10 min, 取上清液, 加入双抗 (含 200 U/ml 青霉素和 200g/ml 链霉素) 混合, 作用 2 h 后, 取 0.2 ml接种于 11 日龄 SPF 鸡胚的尿囊腔, 放于 37培养箱中孵育。3648 h 后收取鸡胚的尿囊液, 连续在 SPF 鸡胚上盲传 3 代。4. IBV 分离株 RT-PCR 鉴定和 S1 全长基因扩增提取病毒的尿囊液中的 RNA 基因组, 按照天根反转录试剂盒说明书进行反转录。以合成的 c DNA 为模板, 采用 S1 基因特异性检测引物与 S1 基因全长引物分别进行 PCR 扩增, 反应条件为:95预变性 5 min;95变性 30 S, 54退火 30S, 72延伸 2 min, 35 个循环;72延伸 10 min。PCR 反应结束后取产物以 110V, 50 m A 电流进行电泳, 结果约 25 min 后在凝胶成像系统紫外灯下观察。5. IBV 分离株 S1 基因的克隆测序按照胶回收试剂盒
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