runx2在宫颈鳞癌组织中的表达及其sirna对hela229细胞runx2表达及细胞增殖与凋亡的影响
12页1、RUNX2 在宫颈鳞癌组织中的表达及其siRNA 对 Hela229 细胞 RUNX2 表达及细胞增殖与凋亡的影响 张威 郭文涛 曾宪旭 班振英 郑州大学第三附属医院病理科 广东医科大学基础医学院病原生物实验室 摘 要: 目的:探讨 RUNX2 蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况及 RUNX2 siRNA 对宫颈鳞癌Hela229 细胞 RUNX2 基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用免疫组化技术检测 50 例宫颈鳞癌、30 例宫颈高级别鳞状上皮内病变 (HSIL) 及 30 例正常宫颈黏膜组织中 RUNX2 蛋白的表达情况, 并分析宫颈鳞癌组织中 RUNX2 蛋白表达与临床病理特征的关系。设计合成 RUNX2 siRNA, 通过脂质体将其转染至Hela229 细胞, 同时设立空白对照 (不转染) 和阴性对照 (转染非特异性 siRNA) 细胞组。转染 24、48、72 h 后, 采用 MTT 法检测各组细胞增殖, 计算增殖抑制率;转染 72 h 后, 采用 RT-PCR 及 Western blot 技术检测细胞中 RUNX2 mRNA 及蛋白的表达, 采用流式细胞术检测细胞凋亡。
2、结果:宫颈鳞癌组织中 RUNX2 阳性表达率高于 HSIL 及正常宫颈组织 (P75%记为 4 分;依据细胞染色程度评分:无染色为 0 分, 浅黄色为 1 分, 黄色为 2 分, 棕黄色为 3 分。两项评分的乘积为总分, 总分3 分判定为阳性表达。1.3 Hela229 细胞分组Hela299 细胞经传代培养, 当细胞铺满大部分培养瓶底时 (约 80%90%) 分 3 组培养。 (1) 空白对照组:将细胞常规培养于含体积分数 10%胎牛血清的 DMEM 培养液中, 37、体积分数 5%CO2孵箱中培养, 不进行转染操作。 (2) RUNX2 siRNA 组:根据 Gen Bank 中 RUNX2 c DNA 序列, 遵循 siRNA 设计原则, 参考文献8设计合成 RUNX2 siRNA。反义序列:5-AATGGCAGCACGC TATTAAATCCTGTCTC-3;正义序列:5-AAATTTA ATAGCGTGCTGCCACCTGTCTC-3。RUNX2 siRNA 由上海生工生物工程有限公司合成。取对数生长期的 Hela229细胞, 消化后接种于 6 孔板中, 参考转染试剂盒 Li
3、pofectamine2000 (美国Invitrogen 公司) 说明书将 RUNX2 siRNA (80 nmol/L) 转染到 Hela229 细胞中。转染后于体积分数 5%CO2、37恒温培养箱中培养 5 h, 更换含体积分数 10%胎牛血清的培养基继续培养。 (3) 阴性对照组:细胞按 RUNX2 siRNA 组处理, 但不转染 RUNX2 siRNA, 而转染非特异性的 siRNA。1.4 MTT 法检测 Hela299 细胞增殖抑制率收集对数生长期的 Hela229 细胞, 消化后制备成单细胞悬液, 经细胞计数后按5 000 个/孔接种在 96 孔板上, 按 1.3 分组处理, 分别培养 24、48、72 h 后, 每孔加 20L 的 MTT (5 g/L, 美国 Sigma 公司) 继续培养 4 h, 弃去上清, 加入 200L DMSO, 摇床上低速振荡 10 min 显色。用酶标仪检测各孔 492 nm 处的光密度 (OD) 值, 每组设 3 个复孔, 取平均值。细胞增殖抑制率= (1-实验孔OD 值/对照孔 OD 值) 100%。1.5 流式细胞术检测 Hela2
4、99 细胞凋亡细胞分组培养 72 h 后收集细胞, 制备细胞悬液。取 110 个细胞, 离心弃上清, 重悬细胞后按照 Annexin V-FITC 和 PI 双染试剂盒说明书操作检测细胞凋亡, 以 PI、Annexin V-FITC 单染细胞作为基准参照。用 Cell Quest 软件进行结果分析, 计算细胞凋亡率。1.6 RT-PCR 法检测 Hela299 细胞中 RUNX2mRNA 的表达细胞分组培养 72 h 后, 用 Trizol 试剂 (MRC 公司) 提取细胞总 RNA, 用 M-MLV酶行逆转录后, 进行 PCR。RUNX2 引物序列为 5-GCAGT TCCCAAGCATTTCAT-3和5-GAAGGGTCCACTCT GGCTTT-3, 产物长度 190 bp。内参 GAPDH 引物序列为 5-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3和 5-GACG GACACATTGGGGGTAG-3, 产物长度 419 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成, RT-PCR 试剂盒购于大连宝生物公司。PCR 反应条件:95预变性 2min;95变性 30 s, 55退火
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