化妆品体外哺乳动物细胞微核试验2021
12页1、化妆品体外哺乳动物细胞微核试验In Vitro Mammamlian Cells Micronucleus Test1 范围本方法规定了体外哺乳动物细胞微核试验的范围、试验目的、定义、试验基本原则、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。本方法适用于化妆品原料或产品的致突变性的检测。2 试验目的本试验用于检测体外培养的哺乳动物细胞染色体损伤和非整倍体变异,以评价受试物致突变的可能性。3 定义3.1 微核 micronuclei染色单体或染色体的无着丝粒断片,或因纺锤体受损而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期,无法迁移至两极而遗留在细胞质中。末期之后,单独形成一个或几个规则的次核,被包含在子细胞的胞质内,因比主核小,故称为微核。3.2 着丝粒 centromere染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的DNA区域。3.3 非整倍体aneuploidy二倍体染色体组中缺少或额外增加一条或若干条完整的染色体的变异类型。3.4 非整倍体诱变剂 aneugen作用于细胞有丝分裂或者减数分裂周期,导致细胞分裂异常,诱发非整倍体的物质。3.5 染色体断裂 chromosome breakage染色体臂出现
2、长度大于染色体臂宽度的裂隙。3.6 染色体断裂剂 clastogen引起染色体发生断裂的物质。3.7 细胞毒性 cytotoxicity对细胞结构或功能的有害效应,最终可导致细胞死亡。3.8 致突变性 mutagenicity导致基因或染色体结构中产生可遗传的DNA碱基对序列变化的能力。4 试验基本原则体外哺乳动物细胞微核试验是一种用于检测哺乳动物细胞经受试物处理后是否产生微核的致突变性检测方法。本方法适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和/或诱发非整倍体的能力。如果短期(3 h6 h)处理的试验结果为阴性或不明确时,需要进行无代谢活化系统的长期处理试验(用受试物处理细胞1.52.0个正常细胞周期)。试验分为使用和不使用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B(CytochalasinB,cytoB)两种方法。方法一:在细胞经过受试物处理,有丝分裂前使用cytoB,然后观察分析已完成一次有丝分裂的细胞(双核细胞)微核率。方法二:不使用cytoB,细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率。当选用人类淋巴细胞时,建议采用方法一,因为不同来源的细胞周期不同,而且不是所有的细胞都对植物
3、血球凝集素(PHA)有反应。如果有证据表明受试物干扰cytoB的活性,或cytoB可能影响细胞的生长(如小鼠淋巴瘤细胞株),建议采用方法二。5 试验材料与试剂5.1 细胞株:可选用中国仓鼠肺细胞株(V79或CHL)、中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)、小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)、人类淋巴母细胞株(TK6)或原代培养细胞。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。5.2 培养基:根据细胞类型来选择适宜的培养基。对于V79 、CHL或CHO细胞,常用MEM(Eagle)培养液加入10%胎牛血清和适量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、链霉素100g /mL)。对于L5178Y或TK6细胞,常用RPMI 1640培养液加入10%马血清和适量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、链霉素100g /mL)。5.3 溶液的配制5.3.1 活化系统:通常使用的是S9混合物(S9mix)。S9是从经酶诱导剂(Aroclor 1254或苯巴比妥钠和-萘黄酮联合使用)处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同细菌回复突变试验。S9的使用浓度为1%10%(终浓度)。S9 mix中所加辅助因子的量由
4、各实验室自行决定,但需确保S9 mix的活性,必须能明显活化阳性对照物。也可使用下述方法配制:S90.125 mLMgCl2(0.4 mol/L)0.02 mLKCl(1.65 mol/L)0.02 mL葡萄糖-6-磷酸1.791 mg辅酶(氧化型,NADP)3.0615 mg用无血清MEM培养液补足至1mL。5.3.2 cytoB溶液:用二甲基亚砜(DMSO)配制适当浓度的储备液,避光冷冻保存。cytoB的终浓度通常为3g/mL6g/mL,实验室应根据各种细胞系选择cytoB的适当终浓度,以达到理想的双核细胞出现频率。5.3.3 0.075 mol/L氯化钾溶液: 5.59g氯化钾加蒸馏水至1000mL。5.3.4 固定液: 甲醇冰醋酸为31(V/V),临用前配制。5.3.5 姬姆萨(Giemsa)染液:取姬姆萨染料3.8g,置乳钵中,加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375mL,待完全溶解后,再加125mL甘油,放入37温箱中保温48h。保温期间振摇数次,使充分溶解。取出过滤,室温保存,2周后使用,作为姬姆萨染液原液。使用时,取1份姬姆萨染液原液,与9份1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(
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