疟原虫的镜检技术山东省寄生虫病防治研究所参考PPT

1、1,疟原虫的镜检技术,山东省寄生虫病防治研究所,魏 庆 宽,2,各位领导、专家、同志们：,下午好！,3,疟疾流行于热带、亚热带及温带边缘地区，是重要蚊媒传染病，现有107个国家，约32亿人口受到疟疾传播的威胁，尤其是非洲最为厉害，特定于每年4月25日为非洲疟疾日。考虑疟疾的严重危害，WHO又将该日定为世界疟疾日。,4,世界疟疾日由世界卫生大会在2007年5月第六十届会议上设立，旨在推动全球进行疟疾防治。2008年4月25日为首个世界疟疾日。卫生部结合我国实际情况，决定将每年4月26日作为“全国疟疾日”。我国传染病网络报告系统数据显示，疟疾年报告病例数由2002年的2.4万增加到2006年的6.4万，近年来仍有上升趋势，尤其我省上升趋势更为明显，截止目前2009年疟疾发病人数明显超过去年同期，经济相对落后的鲁南、鲁西南地区发病较高；因此，敬请在座的各位同仁更要关注疟疾防治工作。,5,2008年全国疟疾日宣传口号和主题信息,一、活动主题： 疟疾一种没有国界的疾病（Malaria-a disease without borders）。 二、宣传口号 （一）防治疟疾，消除贫困。 （二）全社会携

2、手，共同抗击疟疾。 三、主题信息 （一）疟疾是由蚊虫传播的传染病。 （二）非洲、南亚次大陆、东南亚的一些国家和地区是疟疾高度流行区，到上述国家及地区工作、生活、学习要谨防疟疾感染。 （三）疟疾的症状主要是发冷、发热、出汗，严重者可导致死亡。 （四）预防疟疾最有效的办法是防止蚊虫叮咬。 （五）早期诊断和全程、足量的规范用药是治疗疟疾的关键。 （六）春季休止期治疗是清除疟疾传染源的重要措施之一。,6,疟疾的实验室诊断,1.病原学诊断：显微镜血涂片检查结果阳性；这种镜检确诊最可靠。 2.免疫学诊断：（1）循环抗原的检测 （2）循环抗体的检测 3.分子生物学技术：PCR和DNA探针已应用与疟疾的诊断。 分子生物学、血清学技术发展迅猛，但是确诊疟疾的“金标准” 仍然是病原学诊断显微镜检查疟原虫。,7,血 检 疟 原 虫是确诊疟疾最可靠的方法,20世纪以来，随着显微镜的不断改进和染色方法的的不断完善，使显微镜检查疟原虫的方法成为疟疾病原学诊断的重要手段。凡是疟疾，最终定能查到疟原虫，不存在没有疟原虫的疟疾。显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方法；因此下面我重点介绍一下疟原虫的镜检技术。,8,疟原虫

3、的镜检技术,1. 血膜制作与染色。 2. 厚、薄血膜中间日疟、恶 性疟各期疟原虫的形态结构及其鉴别要点。（王用斌大夫主讲） 3. 小结、镜检示教及读片练习。,9,血膜的制作（取血时间）,采血时间 现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊断或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜的取血时机。 间日疟在寒热发作期，外周血中主要可见环状体期；发作后数小时（h），见大滋养体期，形态较易辩认，为诊断的有利时机；发作36-48h，可检出裂殖体；发作1-2次后，配子体出现较多。 恶性疟较理想的取血时间是在发作后至20h内取血，初发患者退热后常查不到原虫。,10,血膜的制作（取血操作）,在制作血片前，首先要核对患者的姓名、年龄和住址。,11,取血部位和血量,采血部位和方法：采血部位一般人为耳垂，指头；一人一针，常规消毒、采血。 耳垂或无名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒大米（即火柴头）大小。,12,血膜的制作 用于检查疟原虫的血涂片有两种：一

4、种是将血液涂呈薄膜状，称薄血膜；一种是血液涂成圆盘，称厚血膜。,发热病人血片,标本片,13,薄血膜的制作,薄血膜 用推片一端边缘的中点从取血部分取约11.5微升的血量（相当于1/4火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，并形成25350夹角，待血液向两侧扩展约 2cm2.5cm宽时，均匀而迅速地从右向左推成舌状薄血膜（约2.5cm长）。推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕，位于玻片1/21/3处。,14,厚血膜的制作,厚血膜 用推片的左下角，从取血部位刮取约45微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转24圈，涂成直径0.81cm大小圆形厚血膜(厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个自细胞为宜)，厚血膜的位置，位于玻片右1/3处。厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。,15,熟练工作者的推片姿势,16,血膜的制作（涂片操作）,涂制厚、薄血膜的位置 通常将

5、厚、薄血膜涂在一张载玻片上。方法是将载片分为6等分，第1、2格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部。作为标本的血片每张玻片涂厚、薄血膜各1个；门诊和发热病人血片每片1人， 涂2个厚血膜1个薄血膜， 以防血膜脱落而影响检查；,标本片,发热病人血片,标签,17,各种不同的疟疾血片涂制法：,标准血片（1人）,门诊发热病人血片（1人）,居民普查血片（2人）,18,厚薄血膜的标准,厚血膜血量适宜，不宜过多或过少。 薄血膜平整，无皱折和空泡，红细胞单层排列。,19,标准的疟疾厚薄血膜位置,20,全国疟疾镜检知识与技能竞赛 血片制作和染色质量评价标准 好血片制作质量: 厚血膜：血量 4.05.0ul,位置 玻片右13稍偏右,直径 0.81.0cm，外观 圆形厚膜均匀。 薄血膜：血量 1.52.0 ul，位置 玻片1213处，外观 舌状厚薄均匀；染色质量 外观兰紫色；清洁度 外观光洁无油灰。,21,全国疟疾镜检知识与技能竞赛的 竞赛内容及分值比例1.理论知识竞赛内容为：疟疾病原和诊断基本知识。包括：疟原虫生史，血片制作、染色、镜检操作理论，显微镜使用与维护知识。2.

6、技能竞赛内容为：制片染色和镜检读片。包括：厚、薄血片的制作和染色；疟原虫的显微镜镜检，确定阴阳性和虫种，定量计数以及显微镜的使用与维护。3.分值比例：每位选手满分100分，其中理论竞赛20分，技能竞赛80分；技能竞赛中，制片染色15分，镜检读片60分，显微镜使用与维护5分。 将来咱们省内竞赛内容及分值比例参考该标准。,22,血膜的制作,血膜编号 血膜制成后，立即在玻片面上写上受检者的号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类的代号和受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。,23,制作血膜的注意事项,1.清洗玻片，且勿碰撞、磨损。 2.刚涂制的血膜要平放，注意防尘、防昆虫吸吮血膜。 厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果；晾干血膜时应注意防尘、防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。 3.血膜应自然干燥。 切忌在毒太阳下晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天标本尽可能24-48h内固定染色；冬天也不能超过72h。放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定

7、（1-3分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干固定后装入盒内盖严，待以后染色。,24,染液的种类,染液种类：疟原虫的染色，目前临床上应用最广泛的是瑞氏（Wright stain）和吉氏染液（Giemsa stain）。这些染液中的主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成的天青，所以称多色性染剂。 我们主要用吉氏染液，它具有方便，染色效果稳定，便于长期保存的优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如吉氏稳定，主要在门诊量大的门诊实验室使用。,25,染液的染色原理,染色原理是染料于被染物的阴阳离子互相吸附而结合的一种化学反应。 组成红、白细胞和疟原虫等蛋白质的氨基酸电离出的带正电荷的-NH3+和带负电荷的-COO- ，与多色染剂有色基团所带的阴、阳离子相结合，从而使红、白细胞和疟原虫被染上不同的颜色。 疟原虫和白细胞的胞浆被染成蓝色，红细胞、疟原虫和白细胞核被染成紫红色。 红、白细胞和疟原虫的蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷的-NH3+和一个带负电荷的-COO-。碱性染料美蓝的有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷的-COO-部分结合，使之成为蓝色。疟原虫、淋巴和大单核细胞

8、的胞浆、嗜碱性白细胞的颗粒等酸性蛋白质，故被染成蓝色。酸性染料伊红的有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷的-NH2+部分结合，使之呈红色；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞的核着色，可美蓝氧化后产生的天青有媒染作用，于是，在媒染物与染料的共同作用下，疟原虫和白细胞核被染成紫红色。,26,染液的种类及染色原理,注意：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求染液的pH值6.8-7.2较好。 染液偏酸时，所带的正电荷增加，易于伊红结合，使红细胞和疟原虫的核染成鲜红色，而淋巴细胞和原虫的胞浆着色较差；反之，当染液偏碱时，红细胞和嗜伊红白细胞的颗粒等被染成紫蓝色，不易观察。,27,姬氏染液母液配置方法,取姬氏粉0.5克置于研钵中，加25ml甘油充分研磨，倒入60或100ml带有玻塞的有色玻瓶中。在研钵中加少量甲醇，洗去甘油浓液混入瓶内，至25ml甲醇洗净钵中甘油染液为止，塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24h或室温内35天，多加摇动，即成原液。姬氏染液是目前较优良的血膜染剂，即使在炎热天气中，亦可经久不变。 材料： 1、姬氏粉0.5克 2、甘油25ml 3、甲醇25ml 注意： 1.高纯

9、度试剂。 2.所用器皿绝对无水（伊红在水溶液内遇到美蓝或天青 即可互相化合而产生沉淀，从而失去染色力）。 3.边加边磨，充分研磨；整个染色液配制时间不能少于5个小时。,28,姬氏染液的染色方法, 先用甲醇或无水酒精固定薄血膜,再用清水对厚血膜溶脱血红蛋白，然后再进行染色。 注意：吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果. 成批血片染色：将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min（根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 单张血片染色：将处理好的血膜，加姬氏母液1-2滴，加中性蒸馏水15-30滴，染色30分钟左右，然后用清水轻轻将片上的染液冲洗干净，晾干镜检。 较理想的染色结果是红细胞为淡红或淡紫红色，疟原虫的胞质呈蓝色，核为紫红色，疟色素为棕褐色。,29,操作1 （快染） 配制5%染液，（每张血片约需染液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。 操作2 (慢染)配制3%染液：在染色量筒内量2ml蒸馏水或新鲜凉开水， 再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色3040min。清水细缓冲洗，晾干镜检。,吉氏染液浓度,门诊染色,30,质量好的染色 :核呈红色,胞浆呈蓝色。 如果血片偏红，说明染液偏酸性。 如果血片偏蓝，说明染液偏硷性。,外观吉氏染色血片,31,影响染色效果的因素,血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染色技术等有关外，还受到以下因素的影响： （1）染剂、溶剂的质量 染料、甲醇和甘油必须用分析纯，且在配制时所用的器具必须干净而无水份。 （2）染液的新旧 染液存放时间越久，染色力越强。新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常呈现偏碱性。通常在染液配制1-2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。 （3）染液稀释后使用时间 必须现用现稀释染液，当时使用，一般在0.5h内染色力最强。 姬氏和瑞氏染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但

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