第2节核酸的分离纯化ppt课件
27页1、第二节 核酸的分离纯化,主要内容,前言 1 核酸分离、纯化原则 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解 2 分离提取核酸的主要步骤 2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存,核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要对核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。,前 言,Home,1 核酸分离、纯化原则,1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义:遗传信息全部储存在一级结构之中,级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 1.1.2 分离核酸原则: 1)温度不要过高; 2)控制pH值范围(pH值5-9); 3)保持一定离子强度; 4)减少物理因素对核酸的机械剪切力.,Home,1.2 防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键,破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌,提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。,1.2.1 DNA酶抑制剂,
2、(1) 金属离子螯合剂: DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活,因此使用金属二价离子螯合剂,可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉; (2) 阴离于型表面活性剂: 如SDS,该试剂除对核酸酶有抑制作用外,还能使蛋白质变性,并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物,该复合物在高盐溶液中沉淀。,1.2.2 RNA酶(RNAase)抑制剂,RNAase分布广泛,极易污染样品,而且耐高温、耐酸、耐碱,不宜失活。 (1) 皂土(bentonite ) 作用机制:皂土带负电荷,能吸附RNase,使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体,很强的核酸酶抑制剂。 作用机制:与蛋白质中His结合使蛋白变性。 使用注意: 1)DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。 2)容易降解,保存在4 或液氮中; 3)提RNA时,0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 4)剧毒。,(3) 肝素 (4)复合硅酸盐(Macaloid) (5)RNase阻抑蛋白(RNasin) (6)
3、氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),Home,(1) 高速组织捣碎机捣碎 (2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS,吐温80等) (6) 生化法(溶菌酶、纤维素酶等),Home,2.1 细胞的破碎,2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开,同时避免核酸降解。,2.2.1 加入浓盐溶液(如NaCl) 核酸-蛋白质加入NaCl后,破坏静电吸力,使氢键破坏,核蛋白解聚; 2.2.2 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外,还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能;,2. 2.3 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果,并对核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大,能加速有机相与水相分层,减少残留在水相中的酚,同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时,需要振摇,为防止起泡和促使水相与有机相的分离,再加上一定量的异戊
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