怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发课件
42页1、液相色谱柱的选择和方法开发,奥秘科技/AUMI Technologies (US),内容概要,色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发,色谱基本概念回顾,色谱(chromatography),色谱原理 色谱分类:气相/液相和高效液相(HPLC);反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能:分析(种类/定量),纯化 液相色谱仪器结构及功能:泵,脱气机,混合器,进样器(阀),色谱柱,柱温箱,检测器(流通池),分离度,Rs - Resolution N Theoretical Plate Number Selectivity k Retention Factor 拖尾,1.Separation of Compounds A and B,灵敏度,:Limit of Detection :Limit of Quantification 柱效 峰形(拖尾因子),重现性,分离度() 保留时间(,) 选择性( ) 柱效() 灵敏度,色谱柱类型、选择和方法开发,色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响,分离度 - 选择性 键合类型,基质表面特性;流动相、温度 - 柱效 保留体积,粒径,柱长,基质
2、表面特性;流动相, 温度,上样量,流速 峰对称性 基质表面特性,键合类型,流动相,温度 保留体积 柱长,孔隙率,比表面积,基质表面特性,键合类型;流动相,温度 灵敏度 粒径,基质表面特性,键合类型;流动相,温度 稳定性和重现性 基质表面特性,键合类型;流动相,温度 流动相 pH,缓冲盐种类,溶剂;,影响色谱柱性能的主要因素,1、 色谱柱的构型 色谱柱内径 色谱柱长度 2、 固定相柱填料 粒径 比表面积 孔径 孔隙率 基质表面特性: - 表面活性:硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响:长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响: 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) 满足检测器和样品量限制 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高,抗污染,寿命 制备柱 (内径 10 mm) 用于纯化制备,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响:粒径,硅
3、胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响:粒径II,目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m,1.8m,2.2m 快速液相色谱柱:匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层:在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m,3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析,颗粒越小,柱效越高, 但是耐污染性能下降,柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响:比表面积,每克填料的表面积,与粒度,孔径有关 比表面积大,保留增加,载样量增加,平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响:孔径I,多孔材料的95%以上表面在孔内部 样品分子直径小于平均孔径,才能进入微粒内部 孔径至少是样品流体学直径的4倍 300孔径用于:超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径,才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响:孔径II,由于小孔径填料比表面积大,小分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件:C8色谱柱,4.6150mm,3.5um, A溶剂,0.1%TFA水溶液; B溶剂,0.1%
4、TFA于80%乙腈水中; 20min梯度,1030%B;60C,1.5ml/min,柱填料对C18色谱柱性能的影响:硅胶纯度I,2.3-二羟基萘,2.7-二羟基萘,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm,Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,!,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=?,流动相: 甲醇:水=65:35 流速: 1 mL/min 温度: 35 检测波长: 230 nm 进样量: 20 L,硅胶纯度金属含量,硅胶基质类型及发展史,Type A:原料来源:水玻璃;高金属含量,高活性,极性化合物容易形成拖尾和死吸附 Type B:原料来源:有机硅烷(四乙氧基硅烷)水解/烧结/酸洗 杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱,柱填料对C18色谱柱性能的影响:硅胶纯度II,硅胶纯度金属含量,d,固定相对色谱柱性
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