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分离科学---第八章 高效毛细管电泳课件

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    • 1、,高效毛细管电泳 (High performance capillary electrophoresis, HPCE) 高效毛细管电泳是离子或者荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按照其淌度和/或分配系数不同,实现高效、快速分离分析的一种电泳新技术。,电泳技术发展历程: 1937年瑞典科学家Tiselius首次采用电泳技术,分离人血清中5种蛋白。 1981年Jorgenson用75m内径毛细管,利用区带电泳实现了正负离子的分离分析,成为毛细管电泳技术的里程碑。 1983年,Hjerten发展了毛细管凝胶电泳。 1984年,Terabe等发展了胶束电动色谱,使中性化合物的CE分离成为可能。 1987年,Hjerten提出了毛细管等电聚焦电泳。 1989年出现商品CE仪器,为推广应用起到了促进作用。,人类基因组研究计划中发挥了巨大的作用,毛细管电泳特点 分离模式多,转换容易,适用范围广。 分离效率高。理论塔板数40万块/m。 速度快。多数30min,最快几秒钟。 试剂和样品消耗少。分离溶剂仅为几l,进样量nL(10-9L)级。 成本低,操作简便,环境污染小。 应用领域十分广泛。在生命科学、药

      2、学、医学、中药分析、食品化学、环境化学和法医学等领域都得到广泛的应用。,毛细管电泳基本原理 预备知识:双电层和Zeta电势 双电层 由界面化学可知,固体与液体接触时,固体表面分子离解或者(和)表面吸附溶液中的离子,在表面形成双电层。,吸附层 (紧密层),双电层模型和相应的电势分布,扩散层,0为表面电势,紧密层中电势线性下降至d。剪切面上的电位称为Zeta电势(),略低于d,一般认为与d相等。 表面吸附了非离子表面活性剂或大分子后,剪切面外移,与d差别变大,甚至会改变符号。,当d衰减到原来的1/e时,离紧密层的距离定义为扩散层的厚度()。 Zeta电势正比于扩散层厚度 。毛细管壁上的Zeta电势为:,e为溶液中每单位面积总的过剩电荷,为介质的介电常数。,带电粒子在其有效半径所组成的面存在Zeta电势:,扩散层的厚度与电解质的浓度有关,确切地说与离子强度有关。对于二元电解质,近似有:,电泳(Electrophoresis) 在半导电流体中,带电粒子在外加电场作用下的泳动现象叫电泳。带电粒子的移动速度可以表示为:,球形粒子:,棒状粒子:,影响电泳速度的因素: 电场强度E 介质特性(介电常数和

      3、粘度) 粒子的有效电荷 粒子大小和形状 因此,荷质比差异是电泳分离的基础。,淌度(Mobility, ) 因为电泳速度与外加电场强度有关,所以,在电泳中常用淌度而不用速度来表示带电粒子的电泳行为和特性。,绝对淌度(absolute mobility,mab) 无限稀释条件下单位电场强度下离子的平均迁移速度。它是该离子在一定溶液中的一个特征物理常数。在手册中可以查到一些离子的绝对淌度。,有效淌度(effective mobility,ef) 有效淌度是实验测出的离子淌度,它是所有产物的离解度(i)和分子的第i离子形式的绝对淌度乘积之总和:,ef取决于许多因素,包括离子半径,溶剂化作用,介电常数,溶剂粘度,离子形状、电荷、pH、离解度和温度等。,电渗流(Electroosmotic flow, EOF) 在毛细管中,电渗流指的是体相溶液在外加电场下整体朝一个方向运动的现象。,(A)EOF不存在流速场,无展宽;(B)HPLC存在流速场,展宽大。,电渗流在CE中的意义 将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移 通过EOF的大小和方向的控制,还可以影响CE 的分离效率,选择性和分离度 E

      4、OF的细微变化会影响CE分离的重现性(迁移时间和峰面积)。,EOF速度的大小与毛细管管壁的Zeta电势有关:,式中为0真空介电常数。 类似于电泳,常用电渗流系数或电渗淌度来表示EOF大小:,影响电渗流的因素主要有: 电场强度E 毛细管材料 溶液的pH 电解质溶液的成分和浓度 添加剂 温度,eo E关系曲线,电场的影响,EOF和pH的关系曲线,毛细管材料以及pH的影响,电解质溶液的成分和浓度,相同浓度的不同的电解质,溶液的介电常数、离子强度以及粘度不同; 同一缓冲液,浓度增大、离子强度增加,双电层变薄,Zeta电势下降,因此EOF变小。,50mmol/L钠盐缓冲液中测得的电流和电渗淌度(pH8.0),添加剂对EOF的影响 中性盐(K2SO4),双电层变薄,EOF降低; 两性离子(四甲基氯化铵)增加溶液粘度,降低pH,EOF降低; 有机溶剂甲醇、乙腈等降低离子强度(有利于提高Zeta电势)、粘度。但通过氢键或偶极作用于管壁,改变表面电荷,这些共同作用的结果一般使EOF变小。 表面活性剂,显著改变毛细管内壁的电荷特性。当表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度以后,将形成胶束,这个时候CE的分离机理

      5、会发生变化。,阳离子表面活性剂浓度对eo的影响(pH9.1),温度对EOF的影响 温度对EOF的影响是线性的。EOF随温度的变化主要是温度影响粘度变化的结果。温度升高时,溶液粘度下降,因此EOF变大。 由于焦耳热的存在,毛细管内溶液的温度会发生变化引起柱效下降,以及分离时间重现性较差,因此,良好的散热是非常必要的。一般有空气冷却和液体冷却两种方式。,调控EOF的方法: 改变缓冲液成分和浓度 改变pH 加入添加剂 毛细管内壁改性(物理或化学方法涂层及动态去活) 改变温度 外加径向电场(改变管壁的Zeta电势),溶质有效迁移速度和表观淌度 在CE中由实验决定的实际的离子迁移速度,称为有效迁移速度(vef):,ap称为表观淌度(apparent mobility),或者净淌度(net mobility)。,分离效率和分离度 理论塔板数 Giddings方程定义为:,纵向扩散是区带展宽的最主要因素,使用高电场 EOF速度快 扩散系数小的溶质,分离度,外加电压(V); 有效长度和总长度之比(l/L); 电泳有效淌度差(ef); EOF淌度(eo)。,区带增宽的因素 (1)扩散 径向扩散影响小,纵

      6、向扩散影响大 (2)进样,(3)温度效应 焦耳热散时形成径向温度梯度,为当量电导,由焦耳热引起的分散系数可表示为:,一般情况下,如果满足下述方程,那么焦耳热热就不会引起太严重的谱带展宽 Ed(c)1/31500 E为电场强度,单位KV/m,c是介质浓度,单位mol/L,d为管径,单位m。,kb背景电解质的热导率,d/dT为溶质淌度的温度系数。,控制焦耳热和温度梯度的方法: 降低电场强度 减小毛细管内径 降低缓冲液的离子强度或浓度 用物理方法控温,(4)溶质与管壁的相互作用-吸附效应 静电引力 疏水相互作用 极端pH,即pH23或pH 9但是极端pH下蛋白质结构会变化甚至水解。 加入中性盐,抑制静电吸附作用,但焦耳热大 加入两性离子化合物如(CH3)3N+CH2CH2CH2SO3-抑制蛋白质吸附 毛细管内壁涂层 动态或者静态地对毛细管内壁进行涂层处理 抑制吸附的方法在一定程度上会影响EOF,实际样品分析中,应该根据具体情况综合考虑。,(5)电分散 电分散来源于样品塞与缓冲溶液之间电场强度的差异。,s样品 b背景电解质,样品和背景电解质的ef相近电分散小,峰对称。 ef比背景电解质小很多的

      7、溶质峰拖尾,ef比背景电解质大很多的溶质峰向前倾斜。,(6)检测器 峰的宽度或区带宽度为时间宽度(Wt),实际长度相等的区带产生时间宽度不等的峰,需校正,否则会给计算柱效和定量分析带来误差。,检测器的空间宽度(Wd)不同,紫外检测器几百微米,电导检测器小于50微米,需校正,(7)其它增宽因素层流 两端缓冲溶液不在一个水平面上,高度差诱导产生层流。对于扩散系数小的溶质,以及内径大的毛细管,这种层流的影响非常显著。 场放大CE中的层流效应。在场放大CE中,由于电场强度(由缓冲溶液浓度不同引起)的非均匀分布,导致局部EOF速度差异,在浓度界面两侧产生电渗压,此压力差使得在高、低浓度区域产生层流。,影响CE分析因素 电泳: pH,缓冲液种类和离子强度,电场强度,温度,添加剂,有机溶剂等。 电渗流: pH,缓冲液种类和离子强度,电场强度,温度,添加剂,有机溶剂和毛细管壁的改性等。,毛细管区带电泳(CZE) (capillary zone electrophoresis) 原理: 在充满电解质溶液的毛细管中,荷质比大小不同的组分在电场的作用下,按照迁移速度的不同而进行分离的。 毛细管电泳中使用最为

      8、广泛的一种技术。,以球形粒子为例,荷质比不同是CZE分离的基础。 样品分子本身荷质比不同(pH调控) 与其他试剂作用后产生荷质比差异(配位、形成主客体化合物等),硼酸根-糖;磺化环糊精-样品,CZE分离的调控因素 (1)操作电压,欧姆定律曲线(最佳电压的选择),恒压-最常用,tm与电压的倒数成正比。如果考虑到焦耳热效应,这种函数关系不成立。 恒电流-理论证明,tm与电流I成正比,在缓冲溶液浓度较大或者散热差的情况下,使用恒电流操作会得到较好的结果。 恒功率-严格地讲,毛细管内焦耳热的多少与毛细管内产生的功率成正比,恒功率模式操作可获得好的重现性。 程序改变电压、电流或功率,从而提高分离度,改善峰形,优化分析时间。,(2)缓 冲 液 缓冲溶液类型-影响溶质的流体力学半径 浓度-离子强度不同,粘度不同 pH-离解程度不同,电荷不同,pH7.0条件下分离丹酰化氨基酸时,相同浓度的NaH2PO4比KH2PO4的分离度高,分析时间短。,分离glycoforms A:乙酸盐0.1mmol/L,Ph4.0; B:乙酸盐-磷酸盐,0.1mmol/L,Ph4.0;,缓冲液选择方法: 有好的缓冲容量 尽可

      9、能选择浓度大而产生电流小缓冲溶液,即分子大而荷电小的缓冲介质 表观淌度接近样品的表观淌度 不影响检测 常用的缓冲溶液有磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)以及一些两性有机离子化合物如2-N-环己基乙磺酸等。,(3)添加剂 控制EOF大小和方向 抑制吸附 稳定溶质的结构如蛋白质的三级结构 增加疏水溶质的溶解度 扩大分离对象,如添加手性物质进行手性分离,添加络和剂分离中性分子等。,表面活性剂-浓度低于其临界胶束浓度,用作助溶剂和离子对试剂,或壁表面改性剂 中性盐-减弱静电作用,抑制管壁对生物大分子的吸附作用,某些盐如LiCl可稳定蛋白质的三级结构的作用 两性离子添加剂-抑制管壁对生物大分子的吸附作用 有机溶剂-EOF降低、粘度降低、离子强度降低,电导率降低、脂溶性样品溶解度增加。例如在30%有机溶剂存在下,SO42-/NO3-的迁移顺序会发生反转。 手性添加剂-环糊精衍生物、冠醚衍生物进行手性物质分离 尿素等起到助溶和改变分离选择性的作用。,(4)温度 温度增加,粘度减小,淌度增加,分析速度加快,但扩散增加 温度高时进样体积大。压力进样,溶液粘度小了,因此进样体积大。电迁移进样,离子淌度大了,毛细管电流大,进样体积同样增大 引起生物大分子结构和生物特性发生变化 影响溶质化学平衡,温度对肌红蛋白分离的影响,原因是血红素中的Fe由Fe(III)还原成Fe(II),温度升高加速还原的发生和进行(氨基酸残基作为还原剂)。,50mmol/LNa2B4O7(pH9.3) 1、甘露糖;2、半乳糖;3、葡萄糖;4、木糖 20C时,峰显著宽而且葡萄糖与木糖分不开。温度升高,分离效率明显增大。原因是络和反应平衡速度加快,产生更加窄的峰。,温度对单糖CZE分离的影响,CZE动态分离 前面讲的CZE,是样品在均匀电场下进行分离的。类似于液相色谱中的梯度淋洗,动态调节背景电解质的组成(浓度、pH),可以在CE分离中形成梯度变化,或者局部基质动态变化,即在非稳态介质中和非均匀电场下进行CZE分离。,非均匀电场下的CZE分离: 外加电压前,毛细管充满电解质1,称为初始电解质。其电阻率为r1,R=Lr1为毛细管内电阻。因为填充的是均匀电解质,因此纵向的电场是

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