分离科学---第八章 高效毛细管电泳课件
132页1、,高效毛细管电泳 (High performance capillary electrophoresis, HPCE) 高效毛细管电泳是离子或者荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按照其淌度和/或分配系数不同,实现高效、快速分离分析的一种电泳新技术。,电泳技术发展历程: 1937年瑞典科学家Tiselius首次采用电泳技术,分离人血清中5种蛋白。 1981年Jorgenson用75m内径毛细管,利用区带电泳实现了正负离子的分离分析,成为毛细管电泳技术的里程碑。 1983年,Hjerten发展了毛细管凝胶电泳。 1984年,Terabe等发展了胶束电动色谱,使中性化合物的CE分离成为可能。 1987年,Hjerten提出了毛细管等电聚焦电泳。 1989年出现商品CE仪器,为推广应用起到了促进作用。,人类基因组研究计划中发挥了巨大的作用,毛细管电泳特点 分离模式多,转换容易,适用范围广。 分离效率高。理论塔板数40万块/m。 速度快。多数30min,最快几秒钟。 试剂和样品消耗少。分离溶剂仅为几l,进样量nL(10-9L)级。 成本低,操作简便,环境污染小。 应用领域十分广泛。在生命科学、药
2、学、医学、中药分析、食品化学、环境化学和法医学等领域都得到广泛的应用。,毛细管电泳基本原理 预备知识:双电层和Zeta电势 双电层 由界面化学可知,固体与液体接触时,固体表面分子离解或者(和)表面吸附溶液中的离子,在表面形成双电层。,吸附层 (紧密层),双电层模型和相应的电势分布,扩散层,0为表面电势,紧密层中电势线性下降至d。剪切面上的电位称为Zeta电势(),略低于d,一般认为与d相等。 表面吸附了非离子表面活性剂或大分子后,剪切面外移,与d差别变大,甚至会改变符号。,当d衰减到原来的1/e时,离紧密层的距离定义为扩散层的厚度()。 Zeta电势正比于扩散层厚度 。毛细管壁上的Zeta电势为:,e为溶液中每单位面积总的过剩电荷,为介质的介电常数。,带电粒子在其有效半径所组成的面存在Zeta电势:,扩散层的厚度与电解质的浓度有关,确切地说与离子强度有关。对于二元电解质,近似有:,电泳(Electrophoresis) 在半导电流体中,带电粒子在外加电场作用下的泳动现象叫电泳。带电粒子的移动速度可以表示为:,球形粒子:,棒状粒子:,影响电泳速度的因素: 电场强度E 介质特性(介电常数和
3、粘度) 粒子的有效电荷 粒子大小和形状 因此,荷质比差异是电泳分离的基础。,淌度(Mobility, ) 因为电泳速度与外加电场强度有关,所以,在电泳中常用淌度而不用速度来表示带电粒子的电泳行为和特性。,绝对淌度(absolute mobility,mab) 无限稀释条件下单位电场强度下离子的平均迁移速度。它是该离子在一定溶液中的一个特征物理常数。在手册中可以查到一些离子的绝对淌度。,有效淌度(effective mobility,ef) 有效淌度是实验测出的离子淌度,它是所有产物的离解度(i)和分子的第i离子形式的绝对淌度乘积之总和:,ef取决于许多因素,包括离子半径,溶剂化作用,介电常数,溶剂粘度,离子形状、电荷、pH、离解度和温度等。,电渗流(Electroosmotic flow, EOF) 在毛细管中,电渗流指的是体相溶液在外加电场下整体朝一个方向运动的现象。,(A)EOF不存在流速场,无展宽;(B)HPLC存在流速场,展宽大。,电渗流在CE中的意义 将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移 通过EOF的大小和方向的控制,还可以影响CE 的分离效率,选择性和分离度 E
4、OF的细微变化会影响CE分离的重现性(迁移时间和峰面积)。,EOF速度的大小与毛细管管壁的Zeta电势有关:,式中为0真空介电常数。 类似于电泳,常用电渗流系数或电渗淌度来表示EOF大小:,影响电渗流的因素主要有: 电场强度E 毛细管材料 溶液的pH 电解质溶液的成分和浓度 添加剂 温度,eo E关系曲线,电场的影响,EOF和pH的关系曲线,毛细管材料以及pH的影响,电解质溶液的成分和浓度,相同浓度的不同的电解质,溶液的介电常数、离子强度以及粘度不同; 同一缓冲液,浓度增大、离子强度增加,双电层变薄,Zeta电势下降,因此EOF变小。,50mmol/L钠盐缓冲液中测得的电流和电渗淌度(pH8.0),添加剂对EOF的影响 中性盐(K2SO4),双电层变薄,EOF降低; 两性离子(四甲基氯化铵)增加溶液粘度,降低pH,EOF降低; 有机溶剂甲醇、乙腈等降低离子强度(有利于提高Zeta电势)、粘度。但通过氢键或偶极作用于管壁,改变表面电荷,这些共同作用的结果一般使EOF变小。 表面活性剂,显著改变毛细管内壁的电荷特性。当表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度以后,将形成胶束,这个时候CE的分离机理
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