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肝功能测定试剂盒方法

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  • 卖家[上传人]:深****
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  • 上传时间:2020-07-30
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    • 1、脂质氧化(MDA)检测原理:碧云天的脂质氧化(MDA)检测试剂盒(Lipid Peroxidation MDA Assay Kit)采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,TBA)反应产生红色产物的显色反应,随后通过比色法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测。 丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物。动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时,会发生脂质氧化。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物,其中包括MDA。此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平,因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其他生化反应也会产生MDA,例如thrmboxane合酶也可以催化产生,但只要在侧定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收,据此可以通过比色法进行检测。另外,MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm,据此也可以进行荧光检测。检测限1um200um。试剂和材料:产品编号

      2、产品名称包装S0131-1TBA25mgS0131-2TBA配制液6.76mlS0131-3TBA稀释液15mlS0131-4抗氧化剂300ulS0131-5标准品(1mM)200ul保存条件:-20保存,一年有效。TBA和抗氧化剂需避光保存。TBA、TBA配制液、TBA稀释液可室温或4存放三个月。实验方法样品预处理:a 血浆、血清或尿液样品制备后可以直接用于MDA测定b 组织或细胞可以使用PBS或碧云天的Western及IP细胞裂解液(P0013)等裂解液进行匀浆或裂解。对于组织,组织重量占匀浆组织或裂解液的比例为10%;对于细胞,每100万细胞使用0.1ml裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后,10000-12000g离心10分钟取上清用于后续测定。对于一些特殊样品,离心不能获得澄清的上清液的,可以使用0.2um孔径的过滤器过滤以获得澄清的样品溶液。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4进行操作。c 对于组织或细胞样品,样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量。试剂配制a TBA储存液的配制:称取适量TBA,用TBA配制液配

      3、制成浓度为0.37%的TBA储存液。TBA配制液需完全溶解后再使用,可以加热到70以促进溶解。TBA储存液较难溶解,需加热到70,并通过剧烈Vortex以促进溶解。配置好的TBA储存液室温避光保存,至少3个月内有效。b MDA检测工作液的配制:根据待测定的样品数(含对照),参考下表在临检测前新鲜配制适量的MDA检测工作液检测次数1次10次20次50次TBA稀释液150ul1500ul3000ul7500ulTBA储存液50ul500ul1000ul2500ul抗氧化剂3ul30ul60ul150il注意:MDA检测工作液较难溶解,可以70加热,并剧烈Vortex以促进溶解。也可以通过超神处理以促进溶解。配置好的MDA检测工作液必须当天使用。c 标准品的稀释:取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50uM用于后续制作标准曲线。如果样品中MDA的浓度很高,可以增加100、150和200uM的标准品浓度。样品测定:a. 在离心管内加入0.1ml匀浆液、裂解液或PBS等适当溶液作为空白对照,加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线,加入0.1ml样品用于测定;随后加入0.2

      4、mlMDA检测工作液。可参考下表设置检测反应体系:空白对照标准品样品匀浆液、裂解液或PBS0.1ml0.1ml待测样品0.1mlMDA检测工作液0.2ml0.2ml0.2mlb. 混匀后,100或沸水浴加热15分钟。加热时务必注意避免液体暴沸溅出。使用沸水浴,则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管,或用Parafilm封住离心管口,用针头刺1小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热 0.5mlPCR管的PCR仪。c. 水浴冷却至室温,1000g室温离心10分钟。取200ul上清加入到96孔板中,随后用酶标仪在532nm测定吸光度。d. MDA含量的计算:对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度,对于细胞或组织样品,计算出样品溶液中的MDA含量后,可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量,例如umol/mg蛋白或umol/mg组织。注意事项:醛、较高浓度的可溶性糖对反应有干扰,可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收(最大吸收在450nm)。如果可溶性糖对测定有干扰,可以通过测定450nm作为参考波长进行双

      5、波长测定,消除其干扰。GSH和GSSG检测原理GSH(还原型谷胱甘肽);GSSG(氧化型谷胱甘肽)谷胱甘肽(glutathione)是一种由3个氨基酸残基组成的小肽,包括还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。还原型谷胱甘肽是绝大数活细胞硫基的主要来源,对于维持蛋白质中硫基适当的氧化还原状态有重要作用,并且是动物细胞中关键的抗氧化剂。总谷胱甘肽中通常9095%为还原型谷胱甘肽。通过谷胱甘肽还原酶把GSSG还原成GSH,而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG。适当配制反应体系,前后两个反应合并起来后,总谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相当于一个颜色产生的限速因素,总谷胱甘肽的量就决定了黄色的TNB形成量。从而通过测定A412就可以计算出总谷胱甘肽的量。用适当试剂先清除样品中的GSH,然后利用上述反应原理就可以测定出GSSG的含量。用总谷胱甘肽的量扣除GSSH的含量,就可以计算出GSH的含量。检测限本试剂盒的检测下限为0.5uM。一个试剂盒共可以进行100次检测,可以测定100个样品的总谷胱甘肽或GSSG的含量,或可以测定出50个样品中GSH和GSSG的各

      6、自含量。包装清单:产品编号产品名称包装S0053-1总谷胱甘肽检测缓冲液60mlS0053-2谷胱甘肽还原酶150ulS0053-3氧化型谷胱甘肽(GSSG)5mgS0053-4DTNB4.5mgS0053-5蛋白去除剂M1gS0053-6NADPH4mgS0053-7DMSO1.5mlS0053-8GSH清除辅助液2mlS0053-9GSH清除试剂500ul保存条件:-20保存,一年有效。GSSG配制成溶液后,需适当分装,-20保存至少3个月有效。DTNB溶解于DMSO后,需适当分装,-20保存至少3个月有效。蛋白去除剂M配制成溶液后仅限当天使用。NADPH溶解后,适当分装,-70保存。稀释的GSH清除辅助液和GSH清除试剂溶液均需新鲜配制使用。注意事项:所有氧化剂或还原剂都会干扰本试剂盒的测定,提别是DTT、硫基乙醇等含硫基的试剂。NADPH等试剂不太稳定,要严格按照后续说明操作,谨防失活。蛋白去除剂M溶液必须新鲜配制并限当日使用。GSH清除试剂也需新鲜稀释后使用。蛋白去除试剂M较难溶解,可以通过剧烈vortex并适当加热(不超过37)以促进溶解。DMSO在4、冰浴等较低温度情况下

      7、会凝固,可以在20-25水浴温浴片刻至全部融解后使用。实验方法:试剂配制:a. GSSG储备液的配制:在本试剂盒提供的5mgGSSG中加入816ulMillii-Q级纯水,溶解并混匀,即为GSSG储备液,浓度为10mM。除立即待用部分外,其余GSSG储备液适当分装后-20保存。b. DTNB储备液的配制:在本试剂盒提供的4.5mgDTNB中加入1.5ml本试剂盒提供的DMSO,溶解并混匀,即为DTNB储备液。除立即待用部分外,其余DTNB储备液适当分装后-20保存。c. 蛋白去除试剂M溶液的配制:称取0.2g蛋白去除试剂M,加入4ml总谷胱甘肽检测缓冲液,配制成4ml 5%的水溶液。蛋白去除试剂M溶液必须新鲜配制并限当天使用。d. NADPH储备液(40mg/ml)的配制:在本试剂盒提供的4mgNADPH中加入100ulMilli-Q级纯水,溶解并混匀,即为NADPH储备液。除立即待用部分外,其余NADPH储备液适当分装后-70保存。e. 5倍稀释谷胱甘肽还原酶的配制:取50ul谷胱甘肽还原酶,加入200ul总谷胱甘肽检测缓冲液,混匀,即成5倍稀释的谷胱甘肽还原酶。f. 总谷胱甘肽检测

      8、工作液的配制:根据待检测的样品数参考下表配制适当量的总谷胱甘肽检测工作液,表中三种试剂按比例混合后即为总谷胱甘肽检测工作液。1个样品10个样品20个样品5倍稀释谷胱甘肽还原酶6.6ul66ul132ulDTNB储备液6.6ul66ul132ul总谷胱甘肽检测缓冲液150ul1.5ml3mlg. 0.5mg/mlNADPH的配制:取10ulNADPH储备液,加入790ul总谷胱甘肽检测缓冲液,混匀即为0.5mg/mlNADPH。每检测一个样品需50ul 0.5mg/mlNADPH。h. 稀释的GSH清除辅助液的配制:在47ulMilli-Q级纯水中加入53ulGSH清除辅助液,立即混匀。稀释后的GSH清除辅助液不太稳定,每次使用时均需新鲜配制,并仅限当日使用。i. GSH清除试剂工作液的配制:10.8ulGSH清除试剂中加入89.2ul无水乙醇,立即混匀。GSH清除剂工作液每次也需新鲜配制。标准品的制备:a. 把10mM GSSG储备液用蛋白去除试剂M溶液稀释成15uM GSSG溶液。然后依次稀释成10、5、2、1、0.5uM GSSG溶液。取15、10、5、2、1、0.5uM GSSG

      9、溶液六个点做标准曲线。注意:由于GSSG在蛋白去除试剂M溶液中不太稳定,用蛋白去除试剂M溶液配制的GSSG溶液必须新鲜配制使用,不可冻存后再使用。b. 如果需要测定样品中GSSG含量,按照每100ul标准品加入20ul稀释的GSH清除辅助液的比例加入稀释的GSH清除辅助液,立即vortex混匀。然后按照每100ul加入4ulGSH清除试剂工作液的比例加入GSH清除试剂工作液,立即vortex混匀,25反应60分钟。即可用于后续的GSSG含量检测。待测总谷胱甘肽含量样品和标准品的准备:组织样品的准备:取组织用液氮速冻,然后研成粉末。每10mg研碎的组织粉末,加入30ul蛋白去除试剂M溶液,充分vortex。再加入70ul蛋白去除试剂M溶液,用玻璃匀浆器充分匀浆。4放置10分钟后,10000g 4离心10分钟,取上清用于总谷胱甘肽的测定。样品需暂时4保存,不立即测定的样品可以-70保存,但不宜超过10天。对于处理好的组织样品通常需用蛋白去除试剂M溶液进行适当稀释后再进行测定,稀释倍数通常是5-20倍。待测GSSG含量样品的准备:取部分上述准备好的待测总谷胱甘肽含量的样品,按照每100ul样品加入20ul稀释的GSH清除辅助液的比例加入稀释的GSH清除辅助液,立即vortex混匀。再按照每100ul样品加入4ulGSH清除试剂工作液的比例加入GSH清除工作液,立即vortex混匀。25反应60分钟。通过上述反应可以清除高达50uM的GSH,如

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