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1、何谓PCR 简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(InVitro)的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 PCR的要素 基本的PCR须具备.要被复制的DNA模板(Template).界定复制范围两端的引物(Primers).DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料及水。PCR反应包括三个主要步骤，分别是 1).Denaturation2).Annealingofprimers,and3).Extensionofprimers。所谓Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板.而Annealing则是令Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-polymerase)的作用下进行引物的延长(Extensionofprimers)及另一股的合成。PCR的历史 PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现(DNApolymeraseI),而较具

2、有实验价值及可得性的 KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现,但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素,因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素(简称Taqpolymerase),则是于1976年从热泉Hotspring中的细菌(ThermusAquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制(DNArepairreplication)，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的，Dr.Mullis当年服务于一家物科技研究公司(Perkin- ElmerCetusCorporation).目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其

3、它研究方法难望其项背。在1989年，Science将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)，而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物。当然，它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。 影响PCR的因素 PCR是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与PCR诞生的资深研究员HenryErlich所言”在分子生物学的领域中，只要拥有它，你便可以无照营业” (PCRallowspeopletopracticemolecularbiologywithoutaliscence)。也因此，活用及慎用PCR是确保一定品质的必要条件。PCR本身虽然是一个单纯的实验技术，但是一个好的PCR反应及其产物则是受到很多因素的影响。这些因素色括反应中各种原料的浓度(Taq.Polymerase,primers,dNTPs,MgCl2)，也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。当然DNA模板(Template)与引信(Primers)本身条件也占有一定的重要性。近来的观念中，共溶剂诸如Dimethylsulfoxide(DSMO)、glycerol、 Fora

4、mideandTetramethylammoniumchloride(TMAC)也对整个反应产生若干重要的影响。 PCR的运用 PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常(Genemutation,deletion,andrearrangement)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取(DNAsequencing)及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。也可以做DNA指纹(Fingerprints)比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质(Interleukines)及各种生长因子(Growthfactors)基因的表现都可用 PCR来进行质与量的分析。 PCR污染及解决对策PCR检测微量感

5、染因子时，一定要注意产物残留污染的问题。 一污染的预防 进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1.标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2.PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； 3.产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR扩增产物分析产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。（二）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA： 1PCR用水应为高压的双蒸水； 2引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制； 3引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 (三)实验操作注意事项

6、尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 1.戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2.使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 3.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 5.最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8.重复实验，

7、验证结果，慎下结论。 二追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。 （一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 （二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有： 1.模板提取时真空抽干装置；

8、2.凝胶电泳加样器； 3.电泳装置； 4.紫外分析仪； 5.切胶用刀或手术刀片； 6.离心机； 7.冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等； 此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。 8.气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。 三污染处理 （一）环境污染 1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤； 2.紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长

9、，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和 DNA断裂等）均可终止TaqDNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个 500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有 6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。（二）反应液污染 可采用下列方法之一处理： 1.DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列； 2.内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如MspI和TaqI等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h后加热灭活进行PCR； 3.紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法； 4.g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是

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