《海绵种属分子鉴定技术规程》（报批稿）.pdf

1、 ICS 07 060 A 45 中 华 人 民 共 和 国 海 洋 行 业 标 准 HY HY T 海绵种属分子鉴定技术规程 Specification of identifying sponge based on molecular data 报批稿 20 发布 20 实施 自 然 资 源 部自 然 资 源 部 发 布 HY T I 前 言 本标准按照 GB T 1 1 2009 给出的规则起草 本标准由自然资源部提出 本标准由全国海洋标准化技术委员会 SAC TC 283 归口 本标准起草单位 大连海洋大学 中国科学院大连化学物理研究所 大连金普新区农业农村发展服 务中心 本标准主要起草人 付晚涛 曹旭鹏 杜萌萌 苏延明 王刚 吴孟嘉 张世杰 李东子 沈思思 丁小涵 王玄 肖一帆 王少杰 鲁艳莉 李晶莹 HY T 1 海绵种属分子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的原理与方法 海绵样品采集与保存 本标准适用于海绵的样品采集 保存和分子生物学方法种属鉴定 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件 仅所注日期的版本 适用于

2、本文件 凡是不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 GB T 12763 6 2007 海洋调查规范 第 6 部分 海洋生物资源调查 GB T 30744 2014 深海微生物样品前处理技术规范 HY T 058 2010 海洋调查观测监测档案业务规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3 1 海绵 sponge 目前已知仍然生存的最古老 最低等的多细胞动物 在动物界中单独构成多孔动物 门 3 2 DNA 条形码 DNA barcode 生物体内能够代表该物种的 标准的 有足够变异的 易扩增且相对较短的 DNA 片段 用于快速准确识别 鉴定物种 3 3 海绵条形码 sponge barcode 海绵的保守基因序列信息的一种表述形式 3 4 18S rRNA 基因 18S rRNA gene 编码 18S rRNA 基因的 DNA 序列 3 5 HY T 2 细胞色素氧化酶亚基 cytochrome oxidase subunit 编码线粒体细胞色素氧化酶亚基 Cytochrome oxidase subunit 基因的 DNA 序列 简称 COI 3

3、6 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction DNA 模板先经高温变性为单链 在适宜温度下和缓冲液中 两条引物分别与模板 DNA 两条链上的一段互补序列发生退火 接着在 DNA 聚合酶催化下以四种 dNTP 为底物 使退 火引物得以延伸 如此反复变性 退火和延伸 使位于两段引物序列之间的 DNA 片段呈几 何倍数扩增 4 原理 通过聚合酶链式反应 简称 PCR 分别扩增海绵的 18S rDNA 和 COI DNA 的部分序列 测序获得各自序列信息后分别与已经鉴定的海绵 18S rDNA 和 COI DNA 序列比对 以此鉴 定海绵种属 5 仪器与设备 5 1 野外生物样品保存箱或保温箱 5 2 低温冰箱 5 3 研钵 5 5 水浴锅 5 6 高速低温冷冻离心机 5 7 紫外分光光度计 5 8 聚合酶链式反应 DNA 扩增仪 简称 PCR 仪 5 9 电泳仪 5 10 高压灭菌锅 5 11 酒精灯 5 12 液氮罐 6 试剂与材料 6 1 无水乙醇 6 2 70 乙醇 HY T 3 6 2 液氮 6 3 异丙醇 6 4 浓硝酸或浓盐酸 6 5 浓硫酸 6 6 蒸

4、馏水或去离子水 6 7 蛋白酶 K 6 8 Taq 酶 6 9 琼脂糖 6 10 醋酸钾溶液 配方参见附录 A 6 11 细胞裂解缓冲液 配方参见附录 A 6 12 TE 缓冲液 pH 7 6 配方参见附录 A 6 13 10 PCR 缓冲液 配方参见附录 A 6 14 吸管 6 15 载玻片 6 16 采样袋或采样瓶 6 17 聚丙烯离心管 注 除非另有规定 使用试剂均为分析纯 7 海绵样品采集与保存 7 1 海绵样品采集 首先 对于海绵及其周围环境 先拍照或摄像 此外 按照 GB T 12763 6 2007 中 10 2 规定执行 7 2 海绵样品保存 7 2 1 暂时保存 加入无水乙醇与海绵样品的体积比约 4 5 1 然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野 外生物样品保存箱 有条件时 直接放入冰箱冷藏保存 保存时间 1 天 7 2 2 短期保存 暂时保存在无水乙醇中 1 天海绵样品 需要更换全部无水乙醇 然后冷冻保存 1 周 7 2 3 长期保存 暂时保存在无水乙醇中 1 天海绵样品或采集海绵样品需要转移至 20 C 保存 在 20 C 保存约 2 周时间 需要更换全部无水乙醇 乙醇

5、加入量与海绵样品的体积比同样约 4 5 1 然后可继续放在 20 C 保存 在 20 C 继续保存约 3 个月 需要更换全部无水乙醇 然后继 续放在 20 C 保存 由此 在 20 C 条件 可以按此方法连续保存 1 年 HY T 4 7 3 海绵样品记录 海绵样品采集与保存记录于 海绵资源调查采样表 详见附录 B 8 海绵种属分子生物学鉴定方法 8 1 海绵 DNA 提取与纯化 8 1 1 取出保存在乙醇中的海绵样品 在样品几何中心部位取样品约 0 5 g 放入事先用液 氮预冷的研钵中 加入液氮研磨海绵样品成粉末状 8 1 2 将上述研磨成粉末的海绵样品量约 1 5 移入装有 600 L 细胞裂解缓冲液的聚丙烯离 心管中混匀 加入 3 L 蛋白酶 K 在 55 水浴锅上放置 3h 8 1 3 从水浴锅取下装有海绵的离心管 在室温加入 200 L 醋酸钾溶液 振荡 混匀 8 1 4 将步骤8 1 3的离心管在 4 10 000 g 离心力条件下离心 3min 然后将上清液转移 至装有 600 L 异丙醇的 1 个新的聚丙烯离心管中 振荡 混匀 8 1 5 将步骤8 1 4的离心管在室温

6、 10 000 g离心力条件下离心3min 然后吸去上清液 加入 600 L 乙醇 70 振荡 混匀 8 1 6 将步骤 8 1 5 的离心管在室温 10 000 g 离心力条件下离心 3min 弃上清液 8 1 7 重复清洗 DNA 沉淀一次 8 1 8 将步骤 8 1 7 离心管中的上清液吸去 将离心管中 DNA 风干 15 min 8 1 9 将步骤 8 1 8 中 DNA 沉淀溶解于 300 L TE 缓冲液 pH 7 6 作为海绵基因组 DNA 提取液 80 保存 8 1 10 按照 GB T 30744 2014 中 9 2 1 规定 将步骤 8 1 9 收获的 DNA 进行纯度测定 满足要求的 DNA 用于 PCR 扩增 8 2 海绵 18S DNA 序列片段 PCR 扩增与测序 8 2 1 使用扩增海绵 18S rDNA 基因序列片段的特异引物对 18S rRNA F TTG ACG GAA GGG CAC CA 18S rRNA R CAA AGG GCA GGG ACG TAA TC 在 100 L PCR 反应管 中 以海绵基因组 DNA 提取液为模板 以 18S

7、 rRNA F 18S rRNA R 为引物 按照 Taq 酶 产品说明书推荐的优化体系配制 50 L PCR 反应液 8 2 2 把此 PCR 反应管放在 PCR 仪中 按照如下条件在进行 PCR 扩增海绵 18S rDNA 基 因序列片段 首先 94 变性 3 分钟 接着 35 个循环扩增 扩增的温度条件为 94 C 变性 20 秒 55 C 退火 30 秒 72 C 停留 1 分钟 最后 72 C 停留 5 分钟 结束 PCR 反应 8 2 3 从 PCR 仪中取出扩增的海绵基因片段产品 按照 GB T 30744 2014 中 9 2 2 规定使 用琼脂糖凝胶电泳检测合格 然后测序获得待鉴定海绵 18S rDNA 片段序列信息 8 3 海绵 COI DNA 序列片段 PCR 扩增与测序 8 3 1 使用扩增海绵 COI 基因的序列片段的特异引物对 LCO1490 GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G HCO2189 TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA 在 100 HY T 5 L PCR 反应管中 以海绵基因组 D

8、NA 提取纯化液为模板 以 LCO1490 20 pmol L HCO2189 为引物 按照 Taq 酶产品说明书推荐的优化体系配制 50 L PCR 反应液 8 3 3 把此PCR反应管放在PCR 仪中 按照如下条件在进行PCR扩增海绵COI基因序列 片段 首先 94 变性 5 分钟 接着 1 个预循环反应 94 C 30s 45 C 90 s 72 C 1 min 重复 5 次 然后 1 个循环反应 94 C 30s 51 C 40 s 72 C 1 min 重 复 35 次 最后 72 C 停留 5 分钟 结束 PCR 反应 8 3 4 从 PCR 仪中取出扩增的海绵基因片段扩增产品 经电泳检测合格 然后测序获得 待鉴定海绵 COI DNA 片段序列信息 8 4 海绵分子生物学种属鉴定 8 4 1 参照 GB T 30744 2014 附录 C 中 C 3 规定 通过互联网搜索 比对 鉴定微生物 菌属方法 将测序获得的海绵 18S rDNA 片段序列信息和 COI DNA 片段序列信息在在线网 站 http www ncbi nlm nih gov 分别进行 18S rDNA 和

9、 COI DNA 的核苷酸序列比对 结 果记录于海绵分子生物学鉴定记录与结果判定表 见附录 C 8 4 2 根据国际公认的基于海绵 COI DNA 片段序列信息鉴定海绵种属在线网站 http www palaeontologie geo uni muenchen de SBP 进行海绵 COI 基因的核苷酸序列比 对 结果记录于海绵分子生物学鉴定记录与结果判定表 见附录 C 8 4 3 以海绵 18S rDNA 和 COI DNA 的片段序列信息鉴定海绵的判断依据和结果 记录 于 海绵分子生物学鉴定记录表 见附录 C 8 4 4 数据资料处理记录应按 HY T 058 2010 要求归档 附 录 A 规范性附录 溶液 缓冲液 HY T 6 溶液和缓冲液 配方 备注 醋酸钾溶液 60 mL 5 mol L 醋酸钾 11 5 mL 冰醋酸 28 5 mL 纯 水 细胞裂解缓冲液 10 mmol L Tris HCl pH 8 0 1 mmol L EDTA pH 8 0 0 1 W V SDS TE 缓冲液 pH 7 6 100 m mol L Tris HCl pH 7 6 10 mmo

10、l L EDTA pH 8 0 10 PCR 缓冲液 500 mmol L KCl 100 mmol L Tris HCl pH 8 3 15 mmol L MgCl2 1 05kg cm 2 高 压灭菌 10 min HY T 7 A A 附 录 B 规范性附录 海绵资源调查采样表 海区 船名 航次 采样点 经度 纬度 采样时间 年 月 日 时 分 至 年 月 日 时 分 采样工具 水深 序号 样本编号 采集海绵的外形及尺寸 颜色 质量等基本数据 分子生物学样品标号 保存方式 备注 1 2 3 4 5 6 7 记事 采样 记录 校对 HY T 8 B B 附 录 C 规范性附录 海绵分子生物学鉴定记录与结果判定表 鉴定人 单位 时间 年 月 日 至 年 月 日 序 号 分子生 物学样 品标号 海绵样 品记录 名称 海绵 18S rDNA 基因片段 序列信息鉴定结果 序列比对一致性 海绵 COI 基因片段序 列信息鉴定结果 序列比对一致性 海绵分子生 物学综合鉴 定结果 备注 1 98 98 同种 2 98 90 同属 3 90 暂不能鉴定 4 98 90 98 同属 5 98 90

《《海绵种属分子鉴定技术规程》（报批稿）.pdf》由会员木92****502分享，可在线阅读，更多相关《《海绵种属分子鉴定技术规程》（报批稿）.pdf》请在金锄头文库上搜索。