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NGS测序技术与分析流程图精品课件

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卖家[上传人]：高远

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常见问题

1、第一代测序技术 Sanger测序 1977年桑格测定了第一个基因组序列是噬菌体X174的全长5375个碱基 Sanger法核心原理是由于ddNTP的2 和3 都不含羟基其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键因此可以用来中断DNA合成反应在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP 分为 ddATP ddCTP ddGTP和ddTTP 通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列新一代测序介绍三大测序平台的前世今生 LynxMPSS Solexa ABISOLiD 454 IonTorrent Helicos SMRT IlluminaSolexa Roche454 PolonySeq ABIIonTorrent PacificBiosciences Roche 454 454公司可谓新一代测序技术的奠基人 2005年底 454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统 GenomeSequencer20System 被 Nature 杂志以里程碑事件报道开创了边合成边测序 sequencing

2、 by synthesis 的先河之后 454公司被罗氏诊断公司以1 55亿美元收购 454测序原理测序实验流程 1 文库制备根据样品的种类和实验目的将基因组DNA cDNA片段化处理至400 800bp间经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA sstDNA 然后和两个44个碱基长的衔接子 adaptor A B进行平端连接 A B衔接子各自含有20个碱基的PCR引物序列 20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列 TACG 除此之外 B衔接子的5 端还标记有一个生物素基团供后续的分离合适的测序模板使用测序实验流程 2 EmulsionPCR 特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断磁珠结合的文库被扩增试剂乳化形成油包水的混合物每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响整个片段文库的扩增平行进行扩增后产生了几百万个相同的拷贝随后乳液混合物被打破扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验测序实验流程 3 测序反

3、应携带DNA的珠子与其他反应物混合物随后放入PTP板中进行后继的测序 PTP孔的直径 29um 只能容纳一个珠子 20um 然后将PTP板放置在GSFLX中测序开始每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号并被CCD照相机所捕获测序实验流程 4 数据分析 GSFLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长读取超过4 6亿个碱基信息通过GSFLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析 454Pyrosequencing 454的特点与主要应用读长较长 400 600bp通量较低 1Run1M序列 400 600Mb相对成本较高主要应用 denovo测序 Illuminasolexa Solexa测序原理 Illuminasolexa IlluminaSolexa桥式PCR diol diol 1stcycledenaturation IlluminaSolexaBaseCalling TTTTTTTGT TGCTACGAT Solexa的特点与主要应用读长较短 100 150bp通量高 25G每天 120 150G每Run主要应用 RNA

4、测序表观遗传学研究 ABISOLiD SOLiDSequencingbyOligoLigation DetectionOligo连接测序通过连接酶连接再对oligo上荧光基团进行检测 SOLiD5500 xl ABISOLiD测序前期制备 A样品片段化磁珠连接 B乳化PCR3 末端修饰 C磁珠富集转到测序玻片 ABISOLiD测序原理 ABISOLiD荧光结合和结果示例 SRR029969 1VAB 5551 12 381 F3length 35T11 0203 3 1113211010332111302330201 SRR029969 1VAB 5551 12 381 F3length 35 36 8 8 462 6 8 43 95 A SOLiDOligo荧光基团模式图 B SOLiD测序结果示例 ColorSpace SOLiD的特点与主要应用读长较短 50 75bp精度高可达Q40通量高 20 30G每天 1Run可达120G主要应用基因组重测序 SNP检测等 Iontorrent IonTorrent测序原理精度 Examples 90 con dence 10 errorrate Q10 99 con dence 1 errorrate Q20 99 9 con dence 1 errorrate Q30 三种平台的技术差异三种平台的效能参数差异转录组测序测序流程转录组主要分析内容小RNA测序果蝇三种组织中MiRNA表达情况 MiRNA表达模式分析新miRNA预测 miRNA编辑情况分析与统计分析软件介绍质量控制软件 QualityControl 定位软件 Mappingthereads 已知基因差异表达评估软件 DifferentialExpression 新基因鉴定软件 Newgeneidentification 可视化展示软件 Virsulization 基因功能注释软件 GOtermorKEGGpathwayanalysis 数据格式示例 Fastq格式 ColorSpace格式 Phredscore 质量控制利用galaxy进行原始数据处理 GalaxyHistory VGNFASTQ 知识回顾KnowledgeReview 谢谢放映结束感谢各位的批评指导让我们共同进步

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