基因序列分析2013年1024
85页1、分子生物学硕士理论课教学安排 基因序列分析的基本策略 房明丽分子生物学教研室联系方式 fangml Strategiesforanalyzinggenesequence 基因的序列组成分析 一级结构 基因的含量的分析 基因的修饰水平分析 甲基化 测序 NorthernBlot 实时PCR RT PCR 基因序列分析的基本策略 限制性片段长度多态性分析 核酸分子杂交 焦磷酸测序 1 DNA序列测定 2 限制性片段长度多态性分析 3 核酸分子杂交 一 基因的序列组成分析 1 DNA序列测定 DNAsequencing 基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序 解析一级结构最精确的技术就是DNA测序 1 Sanger双脱氧末端终止法 单脱氧核苷酸 dNTP 背景知识 ATCG 3 5 磷酸二酯键 双脱氧核苷酸 ddNTP 不能与下一个脱氧核苷酸结合 1 Sanger双脱氧末端终止法 背景知识 在PCR反应体系中 如果只加入一条引物是什么样子的结果 单引物只能扩增单链DNA扩增的包含引物的单链DNA 不对称PCR asymmetricPCR 是用不等量的一对引物 PCR扩增后产生大量的单链DNA
2、 SSDNA 1 Sanger双脱氧末端终止法 DNApol 原理 合成一系列长短不同的以G为结尾的DNA片段 测序PCR反应体系 原理 1 Sanger双脱氧末端终止法 1 Sanger双脱氧末端终止法 原理 PolyacrylamideGelElectrophoresis PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 泳道上长短不同的寡核苷酸片段在变性聚丙烯凝胶中泳动的距离不同 MOVIE 以不对称PCR技术为中心 利用双脱氧核苷酸终止新链的延伸 从而获得在任何一个核苷酸上随机终止的一系列长度不同的DNA片段 变性聚丙烯凝胶电泳分辨仅差一个核苷酸长度的DNA片段 1 Sanger双脱氧末端终止法 小结 缺点 1 Sanger双脱氧末端终止法 手工测序 泳道间迁移率有差异 对测序的精确性有一定的影响 放射自显影条带较宽 读序列困难 全自动激发荧光DNA测序 2 全自动激光荧光DNA测序 原理基于sanger双脱氧法 第一代测序技术 应用十分普遍 实现制胶 进样 电泳 检测数据分析全自动化 测序长度可以超过1000bp 准确率可达到99 999 荧光标记四种ddNTP 只需做一个反应 四色荧光法 赋予
3、DNA片段4种不同的颜色 一个样品的4个反应产物可在同一泳道内电泳 自动化的毛细管电泳 DNA测序仪 其实它就是将测序PCR产物进行PAGE 电泳时激发出四色荧光 并进行软件分析 四色荧光法 基于Sanger原理的DNA测序法可以分析基因的一级结构序列 分析人工重组的基因分析鉴定基因和基因组分析基因的定点突变 长度可达到1000bp 可检测未知基因 每次只能检测一个样本 3 焦磷酸测序法 焦磷酸测序是一种可行的方法 特点 测序长度短于sanger法 定量测序 操作简单 结果可靠 单核苷酸多态性位点 SNP 分析 等位基因频率测定 细菌和病毒等微生物分型鉴定 疾病相关基因序列的突变位点 基因CpG甲基化的分析 焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的 精确和重复性好的分析的技术 3 焦磷酸测序法 背景知识 什么是焦磷酸 提问 先回忆一下什么是ATP ATP是怎么水解的 ATP水解实际上是指ATP分子中高能磷酸键的水解 ATP ADP 磷酸盐 分子简式 A P P P AMP 磷酸盐 AMP 2分子磷酸盐 P P 焦磷酸 3 焦磷酸测序法 焦磷酸测序实际上就是酶促反应测序技术
4、 背景知识 先认识一下焦磷酸测序种所用到 ATP硫酸化酶 荧光素酶 三磷酸腺苷双磷酸酶 DNA聚合酶 ATP硫酸化酶PPi 5 磷酸化硫酸腺苷 APS ATP荧光素酶 ATP荧光素 氧化荧光素 两种特殊底物 四种酶 APS 荧光素 3 焦磷酸测序法 原理 双磷酸酶 荧光素酶 硫酸化酶 APS 荧光素 DNA聚合酶 第一步 加入测序引物 相关酶 底物 和其他试剂 第二步 每次加入一种dNTP 如果结合 则会产生一个焦磷酸 PPi 第三步 硫酸化酶转化PPI为ATP ATP使荧光素酶发出荧光 产生的荧光强度与结合的核苷酸成正比 第四步 多余的dNTP被降解 开始新一个循环 3 焦磷酸测序法 测序原理 看一下视频 3 焦磷酸测序法 结果分析 每次向反应体系中加入一种dNTP 相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况峰高与掺入的核苷酸数量成正比1分子dNTP掺入 释放出1分子的ppi 生成1分子的ATP 产生单位强度的光信号 序列 TGGCCGGGTCACGAGGCCCTA 3 焦磷酸测序法 特殊注意 dATP需要选择替代物dATPS dATPS不是荧光素酶的底物DNA聚合酶对dATPS的催化效
5、率比对dATP的催化效率高 3 焦磷酸测序法 技术流程 多孔测序 一次可检测96个样本 3 焦磷酸测序法 应用 举例说明1 应用焦磷酸测序法检测纯合子和杂合子 SNP182A G 3 焦磷酸测序法 应用 举例说明 应用焦磷酸测序法检测SNP位点 单核苷酸多态性 SNP 基因组上单个核苷酸的变异 一般而言 变异频率大于1 的单核苷酸变异可称为SNP 人类基因差异小于1 但是人类的表型及对疾病的易感性差异很大 都可能与SNP相关 在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP 1 EFGR过表达于大量的肿瘤组织 在肿瘤的生长 分化种起着重要的作用 2 抗EFGR单克隆抗体具有良好的抗肿瘤活性 3 抗EFGR单克隆抗体治疗肿瘤时个体差异明显 如何预测这种个体差异 是目前抗EGFR肿瘤治疗时面临的一个首要问题 K ras基因突变致使细胞内KRAS蛋白持续活跃从而导致抗EGFR的抗体耐药 K ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益 反而徒增不良反应危险和治疗费用 检测患者细胞内KRAS基因的状况可以预测该患者对特定药物的临床反应 KRAS基因突变主要发生在密码子12 13上 密码子12
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