药品无菌保证原理MD

1、 第一部分 微生物基础知识简介 1 一 微生物生存的环境 n人类生活的环境充斥着 大量微生物 n海拔100英里 约160公 里 以上 n海平面以下600英尺 约 182米 的地方都可以发 现微生物的踪迹 n1英里 5 280英尺或1 609 公里 2 一 常见微生物 种类类基本特点 细细菌 0 5 5 m 生长态时长态时 不耐热热 部分 能形成耐热热芽孢孢 真菌 5 m 50 m 形成芽孢孢随空气扩扩 散 不耐热热 病毒 小于0 1 m 一般不耐热热 0 22 m 过滤过滤 不了 3 一 真菌和细菌 大小真菌 5 m 50 m细细菌 0 5 5 m 主要成员员酵母 霉菌细细菌 细细胞组组成酵母是单细单细 胞 其它为为多细细胞均为单细为单细 胞 细细胞质质 成份 遗传遗传 物质质 DNA 被双层层核膜包裹 真 核 并且还还有如线线粒体 叶绿绿体及 高卡基体等被膜包裹的细细胞器 遗传遗传 物质质 DNA 祼露并游离于细细胞质质 内 原核 并且不含有其它有膜细细胞 器 繁殖方式有性 如大型真菌或无性如酵母 霉菌则则二者兼有 无性 裂殖 孢孢子 霉菌产产生分生孢孢子 生长长繁殖 类类 似 于植

2、物的种子 虽虽不耐热热 但会飘飘 浮于空气中而难难以消除 酵母不会产产生孢孢子 主要只有两个属产产生孢孢子 内生孢孢 子 又名芽孢孢 Bacillus 芽孢孢杆菌属和 Clostridium 梭菌属 细细菌芽孢孢属于 休眠体 一个细细菌细细胞产产生一个芽孢孢 生长长条件20 25oC 3 5天30 35 oC 1 2天 杀灭杀灭 程度 不耐热热 但难难用消毒剂剂消毒 因孢孢 子 处处于漂浮状态态 生长态长态 菌不耐热热 极个别别除外 但 形成芽孢孢后耐热热 4 一 微生物分布特点 微生物无处不在 气源性微生物革兰氏阳性菌较多 它们可形成芽孢 难以杀灭 因此 药品生产需要HVAC 水源性则革兰氏阳性菌居多 不会生成孢子 但会形成细菌内毒素 耐热性差 G G 5 一 生长态菌及孢子 n将植物比喻微生物 不恰当而直观 n如玉米 发芽 生长 种子 前二种相当于微生物 的生长状态 到了种子 对环境的 水分 温度等 耐受性大大增强 n然而 微生物的芽孢 并不是繁殖的手段 而是休 眠体 植物没有这种相对应的东西 n革兰氏阳性菌 气源性 身体上部 呼吸道 n革兰氏阴性菌 则是水源性的 细胞结构不同 n

3、生物指示剂均为革兰氏阳性菌 灭菌用BI为非致病 菌 6 一 细菌芽胞 孢 的形成及其特性 成熟芽孢 孢子壁 母细胞 孢子壁的形成 生长态细胞 摘自 http www microbe org microbes spores asp 内生孢子 产生于 Gram 细菌 芽孢杆菌属Bacillus 梭菌属Clostridium 仅含核酸及少量萌发必需物 皮层含DPA和Ca2 复合物 能抵御各种恶劣环境 可休眠上百万年 真菌孢子因不具上述特性 而不耐热 DPA 吡啶二羧酸 7 一 生物指示剂 BI 的定义 n对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于 定量测定灭菌效力的微生物制剂 USP28 n特点 n用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的 耐受性 稳定性 易培养 及非致病性 n相用于被验证产品 灭菌工艺 生产工艺 n符合有关法规的要求 8 一 什么是芽孢 n当某些细菌遇到不良生存环境条件时 为 保护自身 在细胞内形成一外壁厚而坚硬 的体眠体 该体眠体即称芽孢 Spore 或孢子 n由于其对不良环境的耐受性远高于生长态 细胞 常被用于挑战灭菌工艺 以确认被 灭菌物品无菌的可靠性 9 一 芽孢的特性 n

4、主要产生于Gram 细菌的两个属 n芽孢杆菌属 Bacillus n梭菌属 Clostridium n能抵御各种恶劣环境 可存活上百万年 因为它 n有厚的皮层结构 n仅含核酸及少量萌发必需物 n含水量极低 n休眠体 内生孢子 不可再生 每个细胞只产生一 个芽孢 真菌孢子属于分生孢子 不具上述特性 10 芽孢的特点 n耐热 u80 下长期存活 u100 下有相当高的存活率 u100 以上死亡过程符合一级动力学方程 n影响芽孢耐热性的因素 n芽孢存在的介质 n受热时的湿度 11 生物指示剂 BI n对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能用于 定量测定灭菌效力的微生物制剂 USP28 n特点 n芽孢 n用于制备生物指示剂的微生物应具有相当的 耐受性 稳定性 易培养 及非致病性 12 第二部分 热力灭菌基本原理 13 热对微生物的作用 n当高温破坏了细胞中起生命作用的蛋白 质 酶及核酸时 细胞死亡 n生命基本物质的破坏本质上是化学变化 n实验证明微生物受热死亡速度符合一级 动力学方程 14 一级动力学方程式 ndN dt K N0 Nt n N0为t 0时 存活的微生物数 n Nt为t时被杀灭的微生

5、物数 n N为t时存活的微生物数 n K为常数 n对数规则 15 微生物存活数与灭菌时间关系图 半对数座标 Y轴 微生物取对数 X轴 时间为10进制普通座标 t lgN 102030 1 2 3 Y轴及X轴均为普通座标 示意 t N 102030 10 100 1000 16 芽孢的耐热参数 D值 n指一定温度下 将微生物杀灭 90 或下降一 个对数单位所 需要的时间 lgN t 1 2 3 4 t1t2 D 17 灭菌温度对D值的影响 灭菌温度低时 达到同一灭菌效果的时间就长 115 121 125 lgN t lgN 1 D125D121D115 18 F0值 达到同一灭菌效果的概念 F0值即标准灭菌时间 指产品在灭菌过程中获得的与标准参照条 件 121 相同灭菌效果的曝热时间 lgN t LgNo LgNt 121 117 LgN FT Fo 19 不同灭菌温度下的灭菌率 灭灭菌温度 灭灭菌率L 1000 008 1050 025 1120 126 1150 251 1160 316 1180 501 1200 794 1211 000 1221 25 1231 59 n灭菌率

6、为达到与某一温 度下灭菌1分钟相同的灭菌 效果 在121 下灭菌所需 要的灭菌时间 n100 灭菌时1分钟 相当 于121 灭菌0 008分钟 即Fo值为0 008分钟 n105 灭菌40分钟时 Fo 约为 1分钟 能使D值为1分 钟的芽孢数量下降1个对数 单位 20 第三部分 药典对最终灭菌产品的无菌标准 21 无菌检查的局限性 n历史的教训 n1962年 美国FDA颁布第一部GMP n1970 1975年 美国输液污染至败血症400多起 有问题的产品全部通过了无菌检查 n无菌检查的风险 另稿有示例说明 取样样量为为20瓶时污时污 染率与通过过无菌检查检查 概率的关系 批产产品污污染率 5101520 通过过无菌检查检查 的概率 361241 22 药典对无菌保证的定量标准 n1973年的英国药典和1980年USP增补版提到 了无菌的量化标准 nFo不小于8分钟 n经灭菌后 产品中污染菌存活的概率不大于 百万分之一 n中国药典在2000版起 收载了此标准 n无菌保证值 污染菌存活概率的负对数 经 灭菌后 产品的无菌保证值不小于6 23 lgN 2 3 4 5 2 3 4 1 5 6

7、1 0 12345 7 6891012分11 SAL F0 D lgN0 假定D121为1 无菌保证值与Fo D值及带菌量的关系 过度杀灭示意 生产中Fo 8示意 24 无菌 的标准及概念 n 每批产品中 污染品概率不得超过一百万分 之一 无菌的这一量化标准应当可以用试验 来证明的 用无菌检查法显然是不可能的 n然而 每瓶产品微生物存活的概率却可计算的 n这就需要测试产品灭菌前微生物污染数 D值 使用对数规则 并用生物指示剂试验来证实 n量化指标 计算 试验 使无菌标准成为工 业界可执行的标准 25 产品灭菌完全的必要措施 从公式 SAL F0 D lgN0 看灭菌完全的必要措施 n足够的F0值 n产品灭菌前污染菌检测 需氧菌总计数 微生物污染水平 污染菌耐热性 26 产品灭菌完全的必要措施 2 通常采用的中间控制手段 n对每批的灌封开始和结束阶段 分别对灌装好 的半成品取样检测 样品须作需氧菌总计数 将检品液置于100 下加热10分钟 检查是否有耐 热芽孢存活 n须对微生物学检测结果进行趋势分析 27 产品灭菌完全的必要措施 3 FDA要求 对于在灭菌前产品污染菌检测中所发 现的耐热

8、孢子 必须与验证灭菌工艺所 用生物指示剂的耐热性进行对比 28 产品灭菌完全的必要措施 4 具体要求 n如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物 需将 其培养并收集芽孢 测定其的耐热性 将之与验证 灭菌工艺用生物指示剂的耐热性进行对比 n如果所分离的污染菌耐热性高于生物指示剂的耐热 性 则必须使用耐热性更强的生物指示剂对灭菌工 艺重新进行验证 可以使用生产中的分离菌 n如果在生产全过程中 对微生物污染严格控制 那 么 这种情况发生的概率是非常小的 29 无菌保证水平举例 n假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数 N0 为100cfu 瓶 污染微生物的耐热参数 D 为1 分钟 要达到药典规定的SAL不小于6的标准 灭菌F0值应达到多少 相当于121 和115 下 灭菌多少分钟 n答 F0 SAL lgN0 D 6 lg100 1 8 分钟 需在121 下灭菌8分钟 n换算成115 下的灭菌时间是 F0 L115 8 0 25 32分钟 30 n某复方氨基酸注射液采用110 30分钟的灭 菌程序 起始污染微生物仍为100cfu 瓶 D值 为0 5分钟 请计算无菌保证值和残存微生物污 染的概率

9、n答 其SAL为 SAL F0 D lgN0 L110 t D lg100 0 08 30 0 5 2 2 8 n残存微生物的概率为10 2 8 0 158 n通过无菌检查的概率为 1 0 158 20 96 9 无菌保证水平举例二 31 第四部分 注射剂常见灭菌方法 32 湿热灭菌 1 n湿热灭菌通常指一定压力下的蒸汽灭菌 也包括过热水灭菌 水浴式或喷淋式 n实际上只要微生物处于达到水 水蒸气 平衡状态下的灭菌过程 都是湿热灭菌 n例 实验室给微生物取样瓶灭菌时通常加入 1ml水并密封 n水分的存在有利于灭菌 33 湿热灭菌特点 n蒸汽有利于蛋白质的变性和酶的失活 从而 杀灭细胞 n 蒸汽热穿透性强 n 灭菌效率高 n温度相对较低 n灭菌时间相对短 n灭菌过程不产生任何化学物理污染 n灭菌设备控制参数少 运行稳定 方便管理 34 湿热灭菌工艺之一 n美国FDA规定的残存概率法 n灭菌过程8 F012 10 6 热稳热稳 定性好的产产品 以杀灭杀灭 微生物作为实现为实现 无菌的手段 残存概 率法 Fo 8 10 6 热稳热稳 定性较较差产产品 工艺过艺过 程将防止产产品被耐热热菌污污染

10、放在首位 而 不是仅仅依赖赖最终灭终灭 菌去消除污污染 流通蒸 汽法 不计计算Fo 0 1 热热不稳稳定产产品 加热热是无菌生产产工艺艺 除菌过滤过滤 的补补充手段 除菌 过滤过滤 法 LRV 7 0 1 不能加热热的产产品 LRV log reduction value 过滤对过滤对 数下降值值 一般 上游为为107下游为为1 则则LRV 7 由于后续续无菌操作较较多 最终产终产 品达到的无菌保 证证水平远远低于除菌过滤过滤 的本身的能力 39 干热灭菌机理 n干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似 符合 对数规则 但灭菌的机理却 并不相同 n干热灭菌为何需较高的温度 n水份的影响 湿度低 n机理不同 干热灭菌是使微生物氧化而 不是使蛋白质变性 40 干热灭菌要点 干热灭菌的介质通常是热空气 n用对数规则描述微生物杀灭过程 准确 性较差 n温度高 200 以上 有可能到320 n用于玻璃容器 手术器械等 n无菌生产工艺中安瓿 西林瓶的灭菌和 去热源 41 干热灭菌与去热原的关系 n去热原的工艺条件比孢子杀灭程序要 苛刻得多 通常相当于标准干热灭菌 时间FH 的数十倍 n如果干热法去热原工

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