菌种传代与保藏教程
33页1、菌种的传代与保藏 内蒙自治区药品检验所 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本 材料,在医学领域中,诊断制品的制备,菌苗的 生产、微生物致病性研究,药物的抑菌试验及药 品微生物检验等都有一套完整的菌种.微生物具 有生命活力,在传代过程中易发生变异甚至死亡 ,因此菌种保藏是一项重要的基础工作,是微生 物学基础工作的一项重要内容,也是药品微生物 工作中的一项常用技术。 一、菌种保藏的意义 如药品中的控制菌检查使用的阳性对照 菌须防止因多次传代而使阳性对照菌的典型 生物学特征发生变化及菌株的死亡,保证达 到菌种长期正确的形态; 如药品微生物学检验过程中,检出的可疑 致病菌须妥善保藏,以达到进一步鉴定的目 的,保证用药安全。 二、菌种代号的意义 l国内药品微生物检验所用的菌种代号是 lCMCC(F)或 CMCC(B) lCMCC 中国医学菌种保藏中心 lB 代表细菌, F 代表真菌。 l大肠杆菌 CMCC (B) 44102 l乙型副伤寒沙门杆菌 CMCC (B) 50094 l铜绿假单胞菌 CMCC (B)10104 l金黄色葡萄球菌 CMCC (B)26003 l生孢梭菌CMCC(B)64
2、941 l白色念珠菌CMCC(F)98001 三、常用菌种保藏方法 (一) 菌种保藏的原理 l根据微生物的菌种生理、生化特性,在人工创造 的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度,使细 胞基本处于休眠状态,生长繁殖受到抑制但又不 至于死亡,以减低菌种的变异率。低温、干燥、 缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代 谢作用。 l低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。 选择保藏方法时,首先应考虑方法能否长期地 保持菌种原有的特性,同时也应兼顾到方法的经济 和简便。在实际工作中,往往多种条件同时使用, 以提高保藏效果。 (二)菌种保藏步骤 挑选特征典型的纯菌菌落; 确定保藏的合适菌体形态; 选择最适宜的保藏方法; 定期对保藏菌种进行检查,观察是否发生变化, 若有变化,须改变保藏方法。保藏期满应及时进 行移种。 1.琼脂斜面低温保存法 l(1)方法:将经常使用的菌种的典型菌落接 种在斜面(某些特殊菌种可用液体培养基)上 ,按规定的温度和时间培养,待充分生长后, 把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好,为减缓培 养基的水分蒸发,延长保藏时间,可将菌种保 藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4左右的冰 箱中保藏
3、。每隔 23个月移种一次,继续进行 保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养,一般 可保藏半年 一年。有的甚至更长时间。 l(2)适用范围:细菌、酵母菌、霉菌保藏。 大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面 生孢梭菌 白色念珠菌 需气菌、厌气菌培养基 真菌培养基 各类菌种保藏条件及时间 菌 种培 养 基 保存温 度 传 种 时 间 细 菌 一般多用于营养琼脂 或根据菌种规定选用 培养基 46 芽孢杆菌36个月, 其它细菌每个月 酵母菌 一般用麦芽汁琼脂或 麦芽汁酵母膏琼脂 46一般46个月 丝状真 菌 一般用PDA琼脂、蔡 氏琼脂或麦芽汁琼脂 等 46 每4个月移植一次( 每2个月移植一次) (3)特点: 优点是简便,易于推广;一般不需 要另选择保藏用培养基;对大多数微生物都 适用。 缺点是保藏期太短;传代次数多, 易发生变异及污染。 (4)注意事项: l保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物,至少 应是第三代的培养物。 l保藏时,破伤风杆菌可用庖肉培养基;生孢梭菌用 流体硫乙醇酸盐培养基。 l 必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌 种管的棉塞是否松动或生霉,如有异常应及时处理 。 l 每次移
4、植后,应与原菌种的编号、名称逐一核对 ,确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。 l 保藏菌种的培养基应无糖,其他菌类含糖小于 2 %为宜,以免产酸过多,影响菌种存活。 l 铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡, 不宜用本法保存。 2、液体石蜡保存法: 本法是用石蜡将培养物与空气隔绝,以降低菌 种的生理生化水平,并可防止水分蒸发,从而延 长菌种的保藏期。 (1)方法: l 将菌种接种于斜面或穿刺于0.3 0.5 %琼脂半 固体高层培养基中,培养好备用。 l取化学纯的液体石蜡装在试管中,每管 1015ml,加棉塞,瓶口包上纸,121高压灭 菌30min,取出置37温箱或 110 170 烤箱 中 1 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。 l 将上述液体石蜡加 入培养好的菌种试管 内,液体石蜡液面以 高出培养基最上端 1 为宜,将试管直立 ,放入4冰箱中保 藏。 l适用范围:适用于保 藏部分霉菌,酵母菌 和放线菌,对细菌保 藏效果较差。 液体石蜡对各类菌种保藏效果 菌 种菌株数 保存时间 (年) 存活率( %) 细菌 霉菌 酵母菌 放线菌 87 586 400 380 5 5 2 4
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