1、中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文硕士学位论文:不同来源动物全血或单核细胞以及人源单核细胞系体外热原检测的方法学研究学 生:秦媛媛导 师:高华中国食品药品检定研究院中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文目录中文摘要.1ABSTRACT.3缩略语表.6前言.7第一章大鼠全血及其外周血单核细胞体外检测热原的可行性研究.10第一节 大鼠全血- TNF- 法检测热原的可行性研究.11第二节第三节大鼠外周血单核细胞法检测热原的可行性研究. 14本章小结.20第二章猪全血法体外检测热原的可行性研究.21第一节第二节第三节猪全血IL-1、IL-6 法用于热原检测的可行性研究21猪全血IL-1、IL-6 法对细菌内毒素的最低检测限及线性关系研究.26本章小结.31第三章家兔外周血单核细胞法体外检测热原的可行性研究.33第四章 人源单核细胞系 THP1 体外检测热原的可行性研究.41第一节第二节第三节THP1-TN F- 法检测热原的可行性研究 . 41THP1-Ne o 检测热原的可行性研究 . . 46本章小结. 50第五章 人源单核细胞系 28SC 体外检测热原的可行性研究 .52第一节2
2、8SC 热原检测体系的建立.53第二节 28SC 热原检测体系对细菌内毒素的最低检测限以及线性关系研究.66第三节传代次数对 28SC 热原检测稳定性的影响.70第四节 28SC 体系对热原复合物的应用研究. 75第五节 28SC 体系对 BET 法不合格样品 b 型流感疫苗的应用研究.81第六节本章小结.87中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文第六章论文结论 .88创新点.90参考文献.91附表 试验相关试剂细菌内毒素含量测定结果.93已发表文章.94综述 三类体外热原检测方法的研究进展.95致谢.106版权声明.107中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文中 文 摘 要目的:本课题以人体发热机理为试验原理,研究二类体外模型:动物全血及单核细胞,人源单核细胞系,考察它们用于检测热原的可行性,以期建立新的体外热原检测体系,并对其进行应用研究。方法:(1) 采用大鼠全血,以细胞因子(TNF-)为检测指标;采用大鼠外周血单核细胞,以细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-)为检测指标;(2) 采用猪全血,以细胞因子(IL-1、IL-6)为检测指标;(3) 采用家兔外周血单核细胞,以细胞
3、因子(IL-1、IL-6、TNF-)为检测指标;(4) 采用人源单核细胞系 THP1,以 TNF-(THP1细胞液 V:热原样品 V=4:1 及 1:1)和 Neo(THP1 细胞液 V:热原样品 V=4:1)为检测指标;(5) 采用人源单核细胞系 28SC,以细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-)为检测指标,考察无活化物存在以及活化物 calcitriol 浓度为 10、100ng/ml 时活化 28SC 后对各类热原的反应活性,确定检测指标以及活化物 calcitriol 的浓度,建立 28SC 热原检测体系,及研究不同传代次数(15、45 代)对 28SC 稳定性的影响;(6) 采用本实验室构建的热原复合物和内毒素法检查不合格的样品 b 型流感疫苗,对人源单核细胞系 28SC 进行应用性研究。对上述试验进行热原检测的可行性研究。结果:(1) 大鼠全血-TNF-法,大鼠外周血单核细胞-IL-1、IL-6 法对 LPS 不能检测到 0.5EU/ml(前期结果表明,LPS 引起家兔体温升高 0.6的最小浓度为0.5EU/ml),不适用于检测热原;大鼠外周血单核细胞-TNF- 法,对
4、LPS 可检测到0.25EU/ml,适用于检测热 原; (2) 猪全血 -IL-1 法对 LPS 的 最低检测限为0.125EU/ml,线性范围为 0.01250.5EU/ml,R=0.9754;猪全血-IL-6 法对 LPS 的最低检测限为 0.0625EU/ml,线性范围为 0.06250.5EU/ml,R=0.9959,猪全血-IL-1、IL-6 法适用于检测热原;(3) 兔外周血单核细胞-IL-1、IL-6、TNF- 法对 LPS 不能检测到 0.5EU/ml,不适用于检测热原;(4) THP1-TNF- 法的两种孵育体系对 LPS均不能检测到 0.5EU/ml;THP1-Neo 法对 LPS 不能检测到 0.5EU/ml,两种指标均不适用于检测热原;(5) 无活化物存在时,28SC-IL-1、IL-6、TNF- 法对 LPS 不能检测到 0.5EU/ml;活化物 calcitriol 浓度为 10ng/ml 时,28SC- IL-1、TNF- 法对中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文LPS 不能检测到 0.5EU/ml,28SC-IL-6 法对 LPS 可检测到 0.25
5、EU/ml,对 LTA 不能检测到 0.5g/ml(前期结果表明, LTA 引起家兔体温升高 0.6的最小浓度为0.5g/ml),对 Zymosan 不能检测到 16.0g/ml(前期结果表明,Zymosan 引起家兔体温升高 0.6的最小浓度为 16.0g/ml);活化物 calcitriol 浓度为 100ng/ml 时,28SC-IL-1、TNF- 法对 LPS 可检测到 0.5EU/ml,对 LTA 不能检测到 0.5g/ml,对 Zymosan不能检测到 16.0g/ml,28SC-IL-6 法对 LPS 可检测到 0.25EU/ml,最低检测限可达到 0.031EU/ml,线性范围为 0.0310.5EU/ml,R=0.9432,对 LTA 可检测到 0.5g/ml,对 Zymosan 可检测到 16.0g/ml,该体系适用于检测热原;确定 28SC 热原检测体系的活化物 calcitriol 浓度为 100ng/ml,检测指标为细胞因子 IL-6;经 LPS 刺激后,45代 28SC 各剂量组与 15 代相应剂量组 IL-6 含量之间无显著性差异,对 LPS 的最低检 测
6、 限均 可 达到 0.031EU/ml , 线 性范 围 均 为 0.0310.5EU/ml , R15=0.9975 ,R45=0.9961;(6) 对于热原复合物,28SC 热原检测体系对其最低可检测到其 16 倍稀释液,而同稀释倍数样品不能引起家兔法体温升高,检测方法灵敏度前者高于后者,对于 b 型流感疫苗,28SC 热原检测体系与细菌内毒素法判定结果一致。结论:(1) 动物全血及单核细胞类模型:大鼠外周血单核细胞-TNF- 法、猪全血-IL-1、IL-6 法适用于检测热原,但其适用性尚需进一步研究;(2) 人源单核细胞系类模型:体外 28SC-IL-6 热原检测体系,适用于检测热原,对 LPS 的最低检测限为 0.031EU/ml,对 LTA 可检测到 0.5g/ml,对 Zymosan 可检测到 16.0g/ml;该体系稳定性好,在 45 代时尚有较好的热原检测活性;该体系对热原复合物的反应灵敏度较家兔法高,对 b 型流感疫苗的判定结果与细菌内毒素法判定结果一致。关键词: 28SC;猪全血法;大鼠外周血单核细胞;体外热原检测;细胞因子中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文M
7、ethodological Study of in vitro Pyrogen Test based onAnimal Whole Blood or Monocytes from Different Originsand Human MonocytesAbstractObjective:This study was based on the mechanism of human body heat, and researchedtwo types of in vitro model: (1) animal whole blood and peripheral-blood mononuclearcells; (2) human mononuclear cell lines. In order to establish a new pyrogen test system,we investigated the feasibility of these two models for the pyrogen test in vitro, andresearched its application.Methods:(1) Take TNF- as the detection indicator for rat whole blood, and IL-1, IL-6,TNF- as the detection indicators for rat peripheral-blood mononuclear cells; (2) TakeIL-1, IL-6 as the
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