细胞生物学技术(二)讲解
68页1、第三节 显微技术 细胞生物学的建立和发展得益于光学显 微镜的发明; 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能 的研究达到了新的水平。 1 光学显微镜与电子显微镜的主要差别 在所使用的光源不同,但分辨率却相 差非常大: 光学显微镜的最大分辨率:0.2m 电子显微镜的分辨率:0.2nm 2 一、显微镜的成像原理 所有类型的显微镜,镜像的形成都需要 3个基本要素: 1、照明系统; 2、被观察的物品; 3、聚焦成像的透镜系统 3 照明系统的波长是显微镜成像的重 要因素,波长能决定被检测物体的最小 极限。 4 1、分辨率(Resolution) 是指能分辨出相邻两个物点间的最小距 离的能力。 一般规定:显微镜或人眼在25cm明视距 离处,能清楚分辨被检物体细微结构最 小间隔的能力,称分辨率。 5 分辨率可用下面公式计算结果来衡量: D=0.61 /N.A. N.A.sin 式中: =波长;n=介质折射率;=镜口角 (标本对物镜镜口张角的1/2),N.A.=镜口率 (numeric aperture)。镜口角总是要小于 90,sin 的最大值小于1。 6 7 不同光源的波长 名称 可见 光 紫外 光 X
2、射 线 射线 电子束 0.1 Kv 10K v 波长 (nm) 450- 760 1339 0 0.051 3 0.00510.123 0.012 2 8 2、最大分辨率 D值越小,分辨率越高,即需要尽可能 地小,和N.A.尽可能大。 可见光中以蓝光波长最短, =450nm; 目前最好的玻璃透镜的=70 , sin =0.94; 空气的折射率n1; 所以光镜的最大分辨率: D=450/1*0.94=292nm=0.3m 9 3、分辨极限与放大率 显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限 。 最终成像的大小与原物体大小的比值称 为放大率(magnification)。 总放大率=物镜的放大率*目镜放大率 放大率受分辨极限的限制。一般,光学 显微镜的最大放大率只能是数值孔镜( N.A.)的1000倍。 10 二、光学显微镜 (一)、普通双目显微镜 *照明系统:可见光源 *光学放大系统:由物镜和目镜组成,都 是由玻璃透镜组构成;在物镜上方装有4 个棱镜,使物镜的光线平分为两路到达目 镜 *机械和支架系统:保证光学系统的准确 配制和灵活调控 11 1. The Light Microscopy(LM
3、) 12 光镜观察样本的制备 石蜡切片. 13 2、倒置显微镜 组成和普通显微镜一样,只不过 物镜与照明系统颠倒,普通显微镜在 载物台之下,倒置显微镜在载物台之 上,用于观察培养的活细胞,具有相 差物镜。 14 15 3、暗视野显微镜 (dark field microscope) 聚光镜中央有挡光片,使照明光线 不直接进入物镜,只允许被标本反射和 衍射的光线进入物镜,因而视野的背景 是黑的,物体的边缘是亮的。 能观察 4200nm的微粒子,分辨率 可比普通显微镜高50倍。 16 17 4、荧光显微镜 是对能发荧光的物质进行定性和定 量研究的工具。 细胞中有些物质如叶绿素等,受紫 外线照射后可发荧光; 有些物质本身虽不能发荧光,但用 荧光染料染色,紫外线照射也发荧光。 18 19 荧光显微镜和普通显微镜区别 : 1、照明方式通常为落射式,即光源通过 物镜投射于样品上; 2、光源为紫外光,波长较短,分辨力高 于普通显微镜; 3、有两个特殊的滤光片,光源前的用以 滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤 除紫外线,用以保护人目。 20 21 22 5、激光共聚焦扫描显微境 (laser conf
4、ocal scanning microscope) *用激光作光源,逐点、逐行、逐面扫描成像,激 光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描 激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。 *调焦一次,扫描限制在样品一个平面。调焦深度 不一时,可获样品不同层次图像,经计算机模拟 ,能显示样品的立体结构。 *激光波长短,光束细,分辨率是光镜的3倍。 23 24 25 26 Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula- stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and belo
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