磷脂酶C和磷脂酶D在核黄素诱导烟草悬浮细胞防卫反应中的作用

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2、号传导中的作用4 1 1 3 2 核黄素介入植物抗病信号传导的可能过程4 1 1 4 激发子诱导细胞信号传导组成部分一5 1 1 5 细胞信号的分类6 1 1 6 细胞化学信号分子与信号传递途径的特征7 1 2 植物细胞磷脂信号系统研究进展8 1 2 1 植物细胞磷脂酶的类别及结构特点。8 1 2 2 植物磷脂酶生化分析10 1 2 3 磷脂酶基因及表达模式1 l 1 2 4 植物磷脂酶的主要生理作用1 2 1 2 4 1 种子萌发。1 2 1 2 4 2 细胞分化和生长1 3 1 2 4 3 光信号13 1 2 4 4 衰老。1 3 1 2 4 5 气孔开口的控制1 4 1 2 4 6 高尔基体新生小泡释放1 4 1 2 4 7 协助m R N A 的核外运l5 1 2 4 8 抗逆境15 1 2 4 9 渗透压调节l5 1 2 4 1 0P L C 和P L D 在植物防卫反应中的作用1 6 1 3 激发子诱导的防卫反应1 7 1 3 1 蛋白质可逆磷酸化作用1 7 1 3 2G 一蛋白1 7 1 3 3 活性氧的产生1 7 1 3 4 离子流动和膜去极化18 1 3 5 一氧化氮

3、的产生1 9 1 3 6 防卫基因的表达1 9 1 3 7 植保素的积累2 0 1 4 研究的目的意义2 l 2 材料与方法 2 1 试验材料2 2 2 1 1 生化和分子试剂2 2 2 1 2 培养基的配制2 2 2 1 3P C R 引物。2 3 2 1 4 烟草悬浮细胞培养和诱导处理2 4 2 2 烟草悬浮细胞总R N A 的提取和纯度测定2 5 2 3 荧光实时定量P C R ( R e a l - t i m eP C R ) j 2 5 2 3 1e D N A 第一链的合成2 5 2 3 2P C R 反应体系及程序2 6 2 3 3R e a lT u n e P C R 结果分析2 6 2 4 烟草悬浮细胞胞外H 2 0 2 含量测定2 7 2 5N O 的定量测定和定性测定。2 8 2 5 1N O 的定量测定2 8 2 5 2N O 的定性测定2 8 2 6R T P C R 分析烟草防卫基因表达2 9 2 7S c o p o l e t i n 含量测定。2 9 3 结果与分析 ，0 、 3 1 核黄素诱导后P L C 和P L D 基因的表达模式3 0 3

4、2P L C 和P L D 抑制剂对H 2 0 2 产量的影响31 一一 7 、 0 七 3 3N O 胞外的定性测定和胞内定量的测定3 3 3 4P L C 和P L D 抑制剂在防卫基因表达方面的作用3 5 3 5P L C 和P L D 抑制剂和P A 在胞内植保素积累的作用3 6 3 6P A 对植保素积累的影响3 8 4 讨论 4 1 f 儿。和N t P L D s 经处理后具有不同的表达特征。4 0 4 2P L C 和P L D 途径对烟草悬浮细胞胞外H 2 0 2 产量的影响4 l 4 3N O 胞外的定性测定和胞内定量的测定4 2 4 4P L C 和P L D 在防卫基因表达方面的作用4 3 4 5 抑制剂和P A 在胞内植保素积累的作用4 3 总结与展望4 5 l 全文总结：4 5 2 研究展望。4 6 参考文献 致谢 I I I 4 7 6 0 _ q 、 f 2 t 气 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 核黄素作为植物防卫反应的激发子，可增强植物对由真菌、卵菌、细菌、病毒等病 害的抗性。但是，其防卫机制并不清楚。磷脂酶C ( p h o s p h o l

5、 i p a s eC ，P L C ) 信号和磷脂 酶D ( p h o s p h o l i p a s eD ，P L D ) 信号途径在动植物防卫反应中起着重要作用。P L C 的水解 产物二酯酰甘油( d i a c y l g l y c c r o l ，D A G ) 和三磷酸肌醇( i n o s i t o ll ，4 ，5 - t r i s p h o s p h a t e ，I P 3 ) ， 以及P L C 和P L D 的共同产物磷脂酸( p h o s p h a t i d i ca c i d , P A ) 。目前对于P L C 信号途径和P L D 信号途径是否参与了烟草悬浮细胞中核黄素诱导的防卫反应还缺乏系统研究。 ， 本文运用药理学方法研究烟草悬浮细胞，为了确定核黄素激发的防卫反应是否依赖 于P L C 和P L D 途径。通过采用生物化学、细胞化学、半定量R T - P C R ( r e v e r s e t r a n s c r i p t a s c - p o l y m c r a s cc h a i nr e a c

6、t i o n , R T - P C R ) 、荧光定量P C R ( R e a l t i m e ，P C R ) 和高 效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , H P L C ) 等技术测定了一系列防卫 反应。所得结果如下： 1 、烟草悬浮细胞受核黄素诱导后N t P L C l 表达量没有明显变化，但其它咒C 和尸肋 基因的表达量均明显增加。N t P L D ( M 兕加2 ，N t P L D a 3 , N t P L D f l l 和N t P L D 6 ) 基因的表 一达水平也表现出差异。 2 、为了阐明P L c 和P L D 是否参与了核黄素诱导的烟草悬浮细胞的过氧化氢( H 2 0 2 ) 的产生，用P L C 的特异性抑制荆U 7 3 1 2 2 和P L D 的抑制剂1 b u t a n o l 提前处理核黄素诱导 的细胞，测定细胞过氧化氢被抑制情况。结果表明U 7 3 1 2 2 ( 1 0p m o l L ) 和1 b u t a n o l ( 0 1 ， - v v ) 对核黄素诱导的过氧化氢产生的抑制率分别为7 9 5 和6 2 9 。但是U 7 3 3 4 3 ( U 7 3 1 2 2 的类似物) 和t e r t - b u t a n o l ( 1 - b

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