1、第7章 微生物的生长和遗传变异,水处理微生物学,第一节 微生物的生长及其特性,第二节 微生物的遗传,本章的知识点:,第四节 遗传工程,第三节 微生物的变异,第五节 微生物的驯化与保藏,本章的重点:,本章的难点:,微生物在间歇培养中生长繁殖的一般规律和在废水处理等实际应用中的指导意义; 利用微生物的变异性改变微生物菌种性能及其在环境保护中的作用。,遗传工程在水污染控制中的应用,生长:个体增大; 繁殖:个体数量增多 生长细菌群体数量的增长,不是个体体积的增长。 提问:为什么这里不考察细菌个体的生长呢? 个体太小,难观察计量 群体细菌对环境产生影响,第一节 微生物的生长及其特性,一、 细菌生长的测定方法,(一)直接计数法 (二) 间接计数法(活菌计数法) (三) 重量法,细菌生长的测定方法,(一)直接计数法 借助显微镜观察测定,优点:快速 提问:有哪些缺点? 缺点:不能区分细菌的死活 分四种,1.涂片染色法,1视野菌液(ml)(0.01ml 1cm2)*视野面积(cm2),2.计数器(血球计数板)测定法,0.1ml菌液,3.比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合,观测二者比例,提问:如果
2、平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5:1,则细菌数量=? 5.5400万个/m l =2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml,女性350450万个ml),平均400万个/ml,4比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,提问:如何定量二者关系呢?,细菌不完全透光,一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,(1)制标准曲线(ODNo),(2)测菌液浊度,查图表得出细菌数量,浊度仪或721分光光度仪,(二)间接计数法(活菌计数法),提问:前述方法中计数的不都是活菌,如何分辨菌死活? 繁殖 提问:细菌繁殖的可见现象是什么? 产生菌落(固体培养基培养)、菌液混浊(液体培养基培养) 计数原理:一个细菌可繁殖成一个菌落 缺点:慢 分固体培养法和液体培养法,无菌水,1. 稀释平板计数法固体培养法,第一步:菌样巧妙稀释,得到不同稀释度 (10-x)菌液,菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图,各取1ml,均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步:培养,稀释度过低,菌落密集无法计数,可以计数,但数量过多,费时费力,数量合适,统计计算,作为结果,数量太少
3、,误差因素太大,不做计数,第二步:接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第四步: 计数,细菌数量=? 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如:10-5稀释度时菌落数为125个 细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法 如国标法水中细菌总数的测定 。 注意:作空白及取平行样(23组)均值减小误差,平均,(三)重量法,提问:已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量? 已知单个细菌的平均重量 除法计算 细菌的湿重量10-1510-11g/个细胞 干重约为湿重的1020。 1. 干重法,方法:含菌水样在105110下进行干燥恒重 (测水中悬浮物重量MLSS或MLVSS)。,1、称重法 用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净,称湿重或干重。 优 点:简单可靠。在活性污泥法中采用的指标: (1)混合液悬浮固体(MLSS)(粗放测定) (2)挥发性悬浮固体(MLVSS)(相对准确),2.细胞含N量法,大多数生物包括细菌,细胞内的蛋白质氮含量比较稳定,一般为蛋白质干重1516,平均为16。 还需要测定
4、哪些条件可以由以上比例确定菌样中细菌浓度? 如何试验操作及计算呢?,3.DNA含量法,同种细菌的DNA含量一致,可通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量,少量纯细菌培养时细菌数量的测定精确性非常高,对样品纯度以及仪器和人员的要求较高 。,二、微生物的生长特性,微生物在培养过程中生长变化的规律 间歇式培养 连续式培养 微生物的生长曲线 微生物重量随培养时间延续的曲线关系 微生物数量随培养时间延续的曲线关系来考察细菌的生长特性,(一)间歇培养和生长曲线,将少量单细胞微生物接种于一定量的液体培养基内,在适宜的条件下培养,在培养的过程中不加入也不取出培养基和微生物,叫做间歇培养(分批培养)。 细菌在新的适宜的环境中生长、繁殖、衰老、死亡的动态变化。 定时取样测定活微生物数目的变化,用坐标法作图,以时间为横坐标,以细胞微生物数量的对数为纵坐标,可以绘出一条有规律的曲线,称为生长曲线。,间歇培养中微生物的生长曲线,迟缓期,衰亡期,稳定期,对数期,总菌数,活菌数,提问:为什么微生物数目用对数值作图?,微生物的数量很大,都是10的n次方,取对数作图时方便。,根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段:,
5、间歇培养的微生物群体生长规律,缓慢期 对数期 稳定期 衰亡期,细胞数量法(缓慢、对数、稳定和衰亡期),(1)缓慢期(停滞期),当细菌被接种到新鲜培养基中,开始一段时间内,通常不立即进行细胞分裂、增殖,生长速率近于零,细胞数目几乎保持不变,甚至稍有减少,这段时间被称为缓慢期。,特征-调整、适应 代谢活跃,体积增大,从介质中快速吸收各种营养物质,大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP和其他细胞成分,为细胞分裂作准备。,与水处理的关系 避免缓慢期的出现。 采用处于对数期或代谢旺盛的污泥进行接种,或增加接种量或采用同型反应器的污泥接种可达到缩短缓慢期的效果。,食物充分,微生物是生长不受食料数量的影响。细胞分裂速度最快、繁殖快,活力很强。微生物数目的对数与培养时间呈直线关系-对数生长阶段。,(2)对数期,与水处理的关系 每个处理污水的能力较高,但整体处理效果并不是最好。 a.微生物活力强大,细胞表面的粘液层和荚膜尚未形成,不易凝聚和沉淀,致使出水水质差; b.需充分的食料,即污水中的有机物必须始终具有较高的浓度,(C进水高,C出水高)。,(3)稳定期,菌体生长繁殖速度逐渐下降,同时菌体死亡数目逐渐上
6、升,最后达到新增殖的微生物数与死亡数基本相等。稳定期的活菌数保持相对平衡并处于最大值。稳定期的出现是由于食料的减少和有毒代谢产物的积累。,与水处理的关系 细胞内开始积累贮藏物质和异染颗粒、肝糖等,强化了微生物的生物吸附能力,污泥代谢活性和絮凝沉降性能较好,传统活性污泥法普遍运行在这一范围。,(4)衰亡期,处于静止期的细菌继续培养,细胞的死亡率将逐渐增加,最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降,此阶段就被称为衰亡期。,与水处理的关系 延时曝气法处理低浓度有机废水:低浓度有机物满足不了静止期微生物的营养要求,处理效果不会好。若采用延时曝气法,通常延长曝气时间在8h以上,甚至24h,延长水力停留时间,以增大进水量,提高有机负荷,满足微生物的营养要求,从而取得较好的处理效果。 污泥消化:即污泥中的有机物在无氧条件下,被细菌降解为以甲烷为主的污泥气和稳定的污泥(称消化污泥)。,衰亡期的长短与对数生长期一样在不同微生物中变化是很大的,主要与菌种的遗传特性有关。 通过补充营养和能源,以及中和环境毒性,可以减缓死亡期的细胞死亡速率,延长细菌培养物的存活时间。,(二) 连续培养,连续培养与间歇培养不
7、同,它的特点是一方面连续进料,另一方面又连续出料。它又分为两种:恒浊连续培养和恒化连续培养。,1.恒浊连续培养,一种使培养液中细菌的浓度恒定,以浊度为控制指标的培养方式。培养基提供足够量的营养元素,细菌保持最大速率生长。通过控制进料流速使装置内细菌浊度保持一定,保持理论上的对数生长期,可获得大量菌体或与菌体代谢相平衡的代谢产物。这种方式往往用于细菌的生理生化研究。,2.恒化连续培养,新鲜培养基以恒定的流速流入,与培养器内的培养基瞬间混合,培养器内的培养基继而也以相同的流速恒定流出,进水组分及反应器中营养物浓度基本不变,因而这种细菌培养称为恒化连续培养。除了SBR法外,其余的污水生物处理法均采用的是恒化连续培养。,第二节 微生物纯培养群体生长规律,三、连续培养,以一定流速输入新鲜培养液并流出培养物,确保流出的老菌数等于新增殖数,使培养保持对数生长的过程。,优 点:一定生理状态实验材料 提高工业生产效益,保持细菌培养液浊度,恒浊培养,第二节 微生物纯培养群体生长规律,三、连续培养,保持细菌培养液营养物质浓度,恒化培养,三、微生物膜的生长特性,(一)生物膜的定义和成分 定义:一种不可逆的黏附
8、于固体表面的,被微生物胞外多聚物包裹的有组织的微生物群体。 成分:微生物、水(含量97%)、微生物分泌的多聚糖、吸附的营养物质、代谢产物、微生物裂解产物 (二)生物膜生长特性 一种动态的演变过程:细胞粘附 生物膜的发展(微生物菌落的生成) 生物膜成熟与脱落,生物膜法是污水生物处理的一种方法。生物膜法采用各种不同载体,通过污水与载体的不断接触,在载体表面微生物细胞生长和繁殖,由细胞内向外伸展的胞外多聚物使微生物细胞形成孔状结构,称之为生物膜。污水利用生物膜的生物吸附和氧化作用,以降解去除污水中的有机污染物。脱落下来的生物膜与污水进行分离。,二、遗传工程技术在环境保护中的应用,1、降解石油的超级细菌 2、耐汞质粒 3、降解燃料的质粒 质粒:在原核微生物和酵母中,除还存在着另一类较小的环状DNA分子,它们也携带少数遗传性基因。它们在细胞分裂中,也能进行复制,这样的DNA构造称为质粒。,由于新的化学物质的不断发现,难降解污染物的增多,废水处理情况日趋复杂。带有降解某些物质质粒的微生物往往不一定能在某一废水环境中生存,而能在此种废水条件下生存的细菌又不一定具有降解其中某些物质的质粒,因而各国科学
9、家正试图利用遗传工程,把具有降解某些特殊物质的质粒剪切后,连接到受体细胞中,使之带有一种或多种功能用以处理废水。这种用人工方法选出的多质粒、多功能的新菌种称“超级细菌”。,1.降解石油的超级细菌 将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细胞,分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒,用遗传工程方法人工转入受体细胞,获得多质粒“超级细菌”,可除去原油中23的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间,用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除,速度快效率高。,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类,用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属,分解DDT等毒害物质。,2.耐汞质粒 主要是某些微生物使水体汞元素甲基化形成甲基汞,使人及生物中毒。另一面自然界中存在一些耐汞的微生物,它们的耐汞基因在质粒R因子上。 例如,恶臭假单胞菌一般在超过2ugml汞浓度中即被毒死,查克拉巴蒂用质粒转移技术,把嗜油假单胞菌的耐汞质粒(MER质粒)转移到恶臭假单胞菌中去,后者获得MER质粒,可在5070ugml氯化汞中生长。 3降解燃料的质粒 假单胞菌K24,具有降解1号橙偶氮染料的质粒,假单胞菌K46,具有降解2号橙偶氮染料的质粒。将这两株假单胞菌通过质粒接合到一个菌株内,可获得具有分解两种偶氮染料功能的新菌种。,三、基因工程的生物安全性问题 我国作为一个农业大国、生物多样性大国,又是大豆、水稻等主要农作物的原产地,在发展生物技术的同时十分重视生物安全。对农业转基因生物采取“积极研究、慎重推广、加强管理、稳妥推进”的方针。 据了解,中国大陆目前正在进行研究的基因工程受体生物92种,而申报只有22种,从事此类研究的单位80多个,申报安全性评价的只有19个。 到目前为止,我国只有2部基因工程安全管理规章: 1993年12月国家科委发布的基因工程安全管理办法 1996年7月农业部发布的农业生物基因工程安全管理实施办法,专题4:生物技术安
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