第三章-细胞生物学研究方法

一、章（节、目）授课计划 第 页授课章节名称第三章 细胞生物学研究方法授课时数2教学目的1、使学生掌握细胞形态结构的观察方法，了解主要工具，侧重掌握基本原理和基本应用2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养3、了解细胞工程技术教学要求1、掌握细胞形态结构的观察方法，掌握光学显微镜技术2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养3、了解细胞工程技术教学重点1、细胞形态结构的观察方法2、细胞组分的分析方法及细胞培养。教学难点1、观察细胞形态的主要方法及工具的介绍。2、细胞组分的分析方法教学方法与手段讲授法、 互动讨论法作业与思考题部分课后作业阅读书目或参考资料1、细胞生物学（第3版）(翟中和等)(高等教育出版社)（2009）2、细胞生物学进展（郑国錩等）（高等教育出版社）（1994）3、分子细胞生物学（韩贻仁）（高等教育出版社）（2007）教学后记二、课时教学内容 第 页教 学 内 容小结技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。第一节 细胞形态结构的观察方法一、有关显微镜的一些概念（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=0.61/Nsin（/2）§ 其中为入射光线波长；§ N =介质折射率；空气中N =1§ =物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例：放大倍数为100×，指的是长度是1m的标本， 放大后像的长度是100m，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d/d二、显微镜的分类现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学教 学 内 容小结显微镜 。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型。三、光学显微镜技术光学显微镜技术至今仍是细胞生物学研究的重要手段。（一）普通复式光学显微镜技术1. 构成： 照明系统：光源、折光镜、聚光镜 光学放大系统：为两组玻璃透镜，目镜与物镜机械装置和支架系统，由镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋和微动螺旋等部件组成，保证光学系统的准确配置和灵活调控。2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。教 学 内 容小结（二）相差和微分干涉显微镜技术光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，提高了各种结构间的对比度，明暗差别通过密度差形成使各种结构变得清晰可见。用途：观察未经染色的玻片标本，样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1. 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。2. 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。 微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。教 学 内 容小结（三）荧光显微镜技术 特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片（激发光滤片，阻断滤片）照明方式通常为落射式（这种照明的光束来自物体的上方通过物镜后射到被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法是适用于非透明物体，检出能力高；对细胞的刺激小；能进行多重染色）。原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位最有力的工具应用：直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术（四）激光共聚焦显微技术原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点（所谓共焦，是指物镜和聚光镜同时聚焦在同一点上），也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。优点是排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构。教 学 内 容小结（五）荧光共振能量转移（FRET）技术是检测活体中生物大分了纳米距离和纳米距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称FRET现象。采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于510nm。FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及作用的强弱。（六）荧光漂白恢复技术又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。用于检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小四、电子显微镜技术用于研究细胞内部的精细结构。（一）、电子显微镜的基本知识1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差教 学 内 容小结2、电子显微镜的特征以电子束作光源，电磁场作透镜。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统等4部分构成；分辨力0.2nm，放大倍数可达106；用于观察超微结构（小于0.2µm）。（二）主要电镜制备技术1、超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备。通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm。 由于电子束的穿透能力有限，为获得高分辨率的图像，切片厚度一般仅为40-50nm，即一个直径为20um的细胞可以切成几百片，故称超薄切片。这需要样品具备一定的刚性和韧性，而生物样品不具备这些特性，因此需要包埋于特殊的介质中，包埋时会破坏样品的结构，因此在包埋前必须先将样品固定。（1）固定：保持样品的真实性，细胞内部结构和成分保持在原来位置上通常以锇酸和戊二醛固定样品，低温，防止酶的自溶而破坏样品结构。（2）包埋：各种细微结构在切片过程中获得均匀良好的支撑，使获得的超薄切片连续完整并有足够的强度，且能耐受观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包埋剂为环氧树脂。注意：生物样品固定后仍含有大量水分，而包埋剂是与谁不相溶的，因此在包埋前通常需要一系列的脱水处理。（3）切片：通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩控制切片厚度。切片刀：玻璃或砖石。切片需捞在覆有支撑膜的载网上才能在电镜下观察。（4）染色：用重金属盐染色以形成明暗反差，只能观察到黑白图像不同的成分对不同的燃料有不同的亲和性：锇酸脂质；铅盐蛋白质；醋酸铀核酸。2、负染技术用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，衬托出样品的精细结构，分辨力可达1.5nm左右。教 学 内 容小结3、冰冻蚀刻 freeze-etching亦称冰冻断裂蚀刻复型。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜面结构，立体感，不需要包埋、固定深度蚀刻主要用来观察胞质中细胞骨架纤维及其结合蛋白。4、电镜三维重构技术将电子显微镜、电子衍射、计算机图像处理相结合的技术。用于分析难形成晶体的膜蛋