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板种细胞问题(不均匀)

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下载须知 | 常见问题汇总

板种细胞问题(不均匀)

细胞不均匀的问题细胞不均匀的问题 原因原因: 1.培养液量少培养液量少,由于瓶体内液体有向边缘吸的特性,所以造成中间低洼,细 胞容易聚集,建议多加液体 2.接种后不要摇晃接种后不要摇晃,传统的思想认为摇一摇能使细胞均匀,但是事实上在摇晃的 时候由于剪应力等多种因素的影响,细胞反而分布不均。 解决方案:解决方案: 1) 接种到培养瓶的细胞,轻轻地让细胞悬液流遍整个瓶底; 2) 接种到培养皿或者培养板的细胞,用枪头对准中央加,让细胞悬液自行 流遍整个孔,若有少量区域未能覆盖到细胞悬液,可用枪头轻轻牵引悬液,千 万不要摇。细胞悬液铺满后,不宜立刻放入孵箱中,我一般静置 用枪头对准中央加,让细胞悬液自行 流遍整个孔,若有少量区域未能覆盖到细胞悬液,可用枪头轻轻牵引悬液,千 万不要摇。细胞悬液铺满后,不宜立刻放入孵箱中,我一般静置15min,这样 接种的细胞很均匀。 3) 培养皿 划 “十” 字交叉轻轻混匀 (力度不易太大, 否则剪切力损伤细胞) , 重复一次。 轻轻放入孵箱即可。 (1)平底和圆底(U 型和 V 型)培养板的区别和选择: 贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用 V 型。 U 型培养板亦多用于培养悬浮型细胞 。V 型培养板有时用做免疫学血凝集的实 验。 (2)细胞培养常见问题与解答 问:我看到培养板有 4、6、12、24、48、96 孔几种规格 ,但不知道到底什么实 验用哪种规格。 答:要根据你具体的实验要求,流式一般用 6 孔,MTT 一般用 96 孔,细胞爬片 一般用 24 孔等,要具体根据你实验来定。 问:我想测吸光度用酶标仪,用多孔细胞培养板行吗?请问酶标板 多孔细胞培 养板有什么区别? 答:用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以拉,我们经常用它来做样品的蛋白定量 和 MTT 检测。 区别:酶标板一般要比细胞培养板贵,细胞板主要做细胞培养,但也可以用来测 蛋白浓度;酶标板包括包被板和反应板,一般不能用做细胞培养,它主要做免疫 酶联反应后的蛋白检测,它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。常用不同 培养板的孔底面积及推荐加液量:不同孔板所加培养液的液面都不宜太深,一般 在 一般 在 2-3mm 范围范围,结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液 量过多会影响气体(氧气)交换,而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加 细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。 (3)细胞培养板的密闭和污染问题 问:96,24 孔培养板或培养皿的盖子都很松,这样是方便了透气,但是细菌、 霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢? 答:1.盖子很松,属于半开放培养,这样的目的是透气(实际上是为了使培养皿 外的 co2 能够与培养皿充分交换,维持培养基的 pH 值) 。 2.凡事有利必有弊,这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的 液体蒸发,这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是 必须的 a 培养箱内空气必须清洁(定期紫外线照,酒精擦洗,尽量少开关培养箱) b 培养箱内的湿度必须始终保持为 100%(培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽) 。 就好像培养皿,也是一个盖倒扣的容器,也不会污染。主要是因为盖子“L”型 边缘产生气流负压的缘故,灰尘上面才附着有微生物,而气流携带的灰尘是无法 通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散,不会产生气流,所 以只会透气不会透菌。 问:我使用 24 孔板,在其中的某些孔中有操作(在超净台内) ,而其它孔中还有 细胞要培养.我很担心这样会污染,不知道要注意什么? 在超净台内如果操作规范的话应该可以的,我想你可以充分利用培养版的盖子, 尽量只暴露要操作的孔,将其它孔用盖子盖起来。这是我的一点粗浅的见解,抛 砖引玉吧! 使用前综合考虑一下,充分使用所以的孔;如果只需要使用少数的孔可以只用一 边的,其余用盖子盖住,我习惯于先用右侧的孔(右手加样方便) 。 其实自己感觉只要注意无菌操作,一般是不会污染的。操作时用几块玻片把板子 一侧垫高,不要把盖子全打开,一般没问题。 (4)细胞分布不均及解决办法 问:我的细胞接种培养板,细胞总是聚集在周边部分,该如何处理啊?我看园子 里有的战友的细胞却是聚集在中间,是不是板子的质量问题啊? 答:请问你的细胞是如何混匀的?是滴管吹打还是振荡培养板?如果是后者,而 且是转圈摇匀转圈摇匀的话, 很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分, 导致细胞 中间少,四周多!自己可是试试! 周边一般是相对会多一点,但是中间的数量也不会很少啊 铺板的时候我也没 有特异去振荡培养板。 大概是板子的质量问题吧或者是不是铺板时候的细胞密度太低了?我用的 corning 的板 。 一个好办法:在你培养种板之前,把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和 后再取出,种入细胞时力量要轻,可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让 细胞悬液流入板孔中,培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振 荡,否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。 在你培养种板之前,把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和 后再取出,种入细胞时力量要轻,可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让 细胞悬液流入板孔中,培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振 荡,否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。 我今天把培养板放入培养箱里几个小时,适当的把细胞密度加大了一下,另外多 加了一点培养液, 今晚看细胞铺的挺好的。 我认为有两种可能解决你问题的办法: 1.加入前吹打均匀;2.从多孔板侧边或底边缓慢加入。 问:我在做原代培养时也遇到过这种情况,我一直以为培养皿铺胶不均匀会导致 这种现象,因为混匀的血管段加入到培养皿中时,在相差显微镜下血管段均匀分 布在培养皿中,24h 后贴壁的血管段就是周边多,中间相对少些。下次我要试试 hkqu 战友的方法看能否改变这种现象。 答: 这种现象很正常呀, 不知你仔细观察过没有, 孔直径愈小, 这个现象越明显, 我试过,24、96 孔板这种现象不可避免,因为液体的附壁使得孔内培养液不是 成一个液平面,而是周边高,就像凹镜一样,而使用这两种孔板由于需要加干预 等原因而不能加足量培养液,使得细胞随培养液一起出现“边集”现象,如果为 了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话,这要看你需要观察何种指 标,如果是 MTT,免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。 (5)6 孔板接种和换液问题: 问:我的细胞传代很正常,但一种到六孔板里(不管加药和对照) ,总有两三个 孔(随机)细胞长得不好,很小,像破碎了。有人遇到过这种情况吗?到底是啥 原因呢?请各位指点 答:可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液,培养基也是从 4 度冰箱拿出来不久,很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱 里边孵育 15min 先。 另外, 跟你细胞的生长状态也有关。 加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。 保证细胞状态良好。 或者放在 37 度水浴锅里孵育也可以,或者是培养板本身的问题,你再换换其它 培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了,种板时的血清浓度调高试一下 问:最近几天,我用六孔培养板接种细胞,培养 24 小时后更换培养基,在更换 培养基之前,显微镜观察到细胞贴壁,状态非常的好,更换了培养基后,立即用 显微镜观察,发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变 得非常小,产生大量的碎片,而另一半的细胞一切正常,异常细胞与正常细胞之 间存在一条分水岭,上半个圆是好的,下半个圆就不好,这是怎么一回事? 答:你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。 你的培养液如何,如果培养液过期,细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试 一试。我也经常碰到,我想可能是板的问题,换一个牌子的板或换用培养瓶就没 问题了。不知楼主所需换液的培养板多不多,换培养基的时候如果没有注意风机 的影响,特别是所需换液的培养板很多时,容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。 如果如此,换液时应该逐个培养板进行,别怕浪费吸管,注意操作的效率! (6)24 孔板接种问题: 问:把细胞消化接种到 24 孔板之后,已经四天了,老是每孔的中间部分长不满, 每天换液时都用 PBS 清洗,第二天换液时都出现同样的情况,每孔的边缘长的 很好,中央大量死细胞? 答:我是选择孔内铺盖玻片,在玻片上种植。每次换液都用 PBS 洗,必要的步 骤吗?另外,也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关? 我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用,培养板的边缘液体会向 上走,造成培养液面呈现一个凹面(就像量筒的液体凹面一样) ,中央的细胞正 好在凹面的最低处,培养液少,细胞的营养不够,甚至干涸掉,空气中的氧气也 会造成损伤,即使有增值过来的细胞也会死掉。 另外,检查一下培养箱底部的水是否少了,如果少了,箱内的空气湿度不够,会 造成培养液挥发加快,这样即使刚加的液体不少,过一段时间,由于蒸发,液体 量会减少,造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度,造成渗透压过 高。 个人经验认为这是物理问题:24 孔板小,细胞接种进去后是很难摇均匀的,结果 导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况.至于中间较多死细胞,如果是悬浮 状的话,也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞,似乎对摇均匀细胞有一定 效果. 在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意,不要把培养基吸得太干,如果完全吸 取,很容易造成细胞干涸,这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这 个问题,一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡,后来发现是上面的原因。 现在我做的时候如果必须把液体吸干,我会一个一个空来吸取,最多一次不超过 3 孔,然后马上加入液体,同时在作转染时,我会在吸液和加液时将风机关掉, 这样基本上会避免细胞死亡 同时在作转染时,我会在吸液和加液时将风机关掉, 这样基本上会避免细胞死亡。 同时你所说的细胞周围密而中间稀疏,大约有如下原因: 1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。 2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。 细胞分布均匀与否有一点很关键,即每种细胞是有个体差异的,别人的细胞操作 不一定适合于你.所以要靠自己摸索,且找出专属于自己细胞的一套规律,有如 下经验: 1.所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。 2.按资料记载,24 孔板的液体量为 1ml,个人也觉得 1ml 的量足矣。 3.接种时,要慢慢加样,且记得轻微旋转枪头,这样做对细胞均匀分布有一定效 果。 4.接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境,个人认为没有必 要在室温放置一段时间。 5.根据细胞的特性,细胞均喜欢聚集在边缘生长,所以我考虑到,你的问题还有 可能是接种时的细胞密度不够,导致周边密集,中间稀疏的错觉。你的拌种密度 是多少? 另“要慢慢加样, 且记得轻微旋转枪头“的意思就是:加样不能太快, 避免细胞在一 个加样处聚集,且注意在不同的部位进行加样,即边加边活动枪头,人为使细胞 趋于均匀分布,我个人觉得有一定的效果,不知这次我解释清楚没有

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