生物化学第14章DNA的生物合成

Putian University,12级临本,1,第14章,DNA的生物合成 DNA Biosynthesis ( Replication ),Putian University,12级临本,2,复制 (replication)：是指由亲代DNA为模板合成两个相同的子代DNA的过程。,DNA的生物合成的方式：, DNA自我复制, DNA修复合成, 逆转录合成,Putian University,12级临本,3,DNA复制的基本特性 characteristics of DNA Replication,第 一 节,Putian University,12级临本,4,半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),DNA复制的主要特征,Putian University,12级临本,5,一、半保留复制,半保留复制：指DNA复制时，母链DNA双螺旋结构解开为两条单链，并各自作为模板，以四种dNTP为原料，按照碱基互补配对原则合成与之互补的新链。使在子代DNA双链中一条来自于亲代，另一条是新合成 。这种复制方式称半保留复制。,1、半保留复制概念,3、半保留复制的意义,体现了遗传的保守性。,2、半保留复制的实验证据,Meselson和Stahl密度梯度实验,Putian University,12级临本,6,Meselson和Stahl密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮N15-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,半保留复制证据,Putian University,12级临本,7,二、DNA复制的方向和方式,1、DNA复制的方向：,由5 3方向合成,以双向复制为主。,2、DNA复制的方式：,大多数原核和真核生物复制时，DNA都是从固定起始点(原核一个起点，真核多个起点)开始向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制方式，即为双向复制。,复制叉,Putian University,12级临本,8,通常把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,复制子(replicon),Putian University,12级临本,9,因为催化DNA合成的DNA聚合酶只能以53方向 合成子代DNA链决定模板DNA链的方向必须是35。,三 、半不连续复制,半不连续复制是指DNA复制时，以35方向为 模板合成新链时是连续合成的。而以5 3 方向为模板合成新链时是不连续合成的。,Putian University,12级临本,10,领头链与随从链,领头链(leading strand)：以35方向的亲代DNA链为模板连续合成的子代链称为领头链。,随从链(lagging strand)：以53方向的亲代DNA链为模板不连续合成的子代链称为随从链。随从链由不连续片段组成。不连续片段称冈崎片段( Okazaki fragment),Putian University,12级临本,11,DNA复制的酶学 和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,Putian University,12级临本,12,DNA复制的反应体系组成:,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol； 模板(template): 解开成单链的DNA母链； 引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合； 其他的酶(解螺旋酶、拓扑异构酶、引物酶、DNA连接酶)和蛋白质因子(单链DNA结合蛋白)。,Putian University,12级临本,13,一、DNA聚合酶,聚合的功能：催化3，5磷酸二酯键的形成,核酸外切水解酶的功能,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)。简称：DNA-pol,1、聚合反应具有方向性: 53,2、聚合反应具有模板依赖性,DNA聚合酶聚合反应特点,3、DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合， DNA新链生成需引物参与,Putian University,12级临本,14,DNA聚合酶的5至3的聚合活性,dTTP,3',(dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + ppi,dTTP,Putian University,12级临本,15,35外切酶活性,53外切酶活性,能切除突变的 DNA片段,能辨认错配的碱基对，并将其水解,DNA聚合酶的核酸外切酶活性,?,Putian University,12级临本,16,(一)原核生物的DNA聚合酶,原核生物DNA聚合酶有三种：DNA-pol、 DNA-pol、DNA-pol,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,小片段,5核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,Putian University,12级临本,17,DNA-pol （120kD）,DNA-pol 功能不详，有研究表明它可能参与DNA损伤的应急状态修复。,DNA-pol (250kD),原核生物DNApol 全酶由10种(、 、´、)22个亚基构成不对称二聚体。,DNA-pol是原核生物DNA真正的复制酶。作用 是在领头链和随从链的引物上进行DNA的延伸。,Putian University,12级临本,18,核心酶含、三亚基,亚基分别催化领头链 与随从链的合成,亚基有3´5´ 外切酶活性及对 碱基的选择功能,亚基为装配所必需,亚基起着夹住模板又 能使酶延模板滑动的作 用。,DNA-pol,Putian University,12级临本,19,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,(二)真核生物的DNA聚合酶,Putian University,12级临本,20,原因：DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对的保证。,复制过程中，DNA复制的保真性至少依赖三种机制：,1、遵守严格的碱基配对规律 2、聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能 3、复制出错时DNA-pol的及时校读功能,二、复制的保真性(fidelity),复制的保真性是指复制产生的子代DNA的碱基序列与亲代DNA的碱基序列所保持的一致性。,Putian University,12级临本,21,1以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA; 2需要模板和引物的存在; 3不能起始合成新的DNA链; 4催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端; 5催化DNA合成的方向是5'3'。,小结：DNA聚合酶的共同性质是:,Putian University,12级临本,22,三、DNA解螺旋酶、DNA拓扑异构酶 单链DNA结合蛋白,(1）解螺旋酶（helicase ), 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。,Putian University,12级临本,23,（2）单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,单链DNA结合蛋白,Putian University,12级临本,24,(3）DNA旋转酶(topoiSOmerase，又称拓扑异构酶),能改变DNA空间构型的酶，既具有水解 、又能连接磷酸二酯键的特点。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。,Putian University,12级临本,25,拓扑异构酶的类型及功能,4、引物酶(primase),引物酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)，能 在DNA复制起始时催化合成一小段RNA作为引物(primer) 。,Putian University,12级临本,26,作用方式：连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。,四、DNA连接酶（DNA ligase）,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,Putian University,12级临本,27,The Process of DNA Replication in Prokaryotes,第 三 节,原核生物DNA复制过程,Putian University,12级临本,28,原核生物、真核生物和病毒中DNA复制的过程基本相同，大致包含3个阶段：复制的起始、复制的延长、复制的终止。包括以下几个步骤：,（1）模板DNA双链解开,（2）RNA引物的合成,（3）DNA链的延长,（4）切除引物,DNA复制的步骤,（5）填补缺口,（6）连接相邻DNA片段,Putian University,12级临本,29,一、复制的起始,（一）、解旋解链，形成复制叉：,解链：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。, 稳定单链：单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。,Putian University,12级临本,30,在原核生物DNA复制的原点（Ori C）富含AT序列，存在两个系列的重复单位：三个13bp构成的串联重复序列和四个9bp构成的反向重复序列。,原核生物的DNA复制起点结构,Putian University,12级临本,31,Putian University,12级临本,32,引发体是DNA复制起始时所形成的一种起始复合 物，由引物酶和几种相关蛋白（如大肠杆菌 的DnaA, DnaB, DnaC）及单链结合蛋白组成。,（二）、引发体的形成与引物的合成,复制起始的主要任务是形成起始复合体(引发 体)，合成引物。,Putian University,12级临本,33,引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,Putian University,12级临本,34,在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。,引物,引物酶,合成引物,Putian University,12级临本,35,复制的延伸指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。,二、DNA链的延伸,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；而在真核生物中是DNA聚合酶。,Putian University,12级临本,36,原核生物DNApol催化前导链与随后链的合成,Putian University,12级临本,37,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,Putian University,12