专题二：DNA的粗提取与鉴定(1)

一、基本原理,提取生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或 化学性质的生物大分子。 对于DNA的粗提取而言，就是利用DNA与RNA、 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异， 提取DNA，去除其他成分。,1、利用DNA在NaCl溶液中的溶解性进行分离 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。,在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ 如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,2、利用DNA不溶于酒精溶液的特性,利用DNA不溶于酒精溶液，某些蛋白能溶于其中的原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。,3、利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,(1)蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没影响。 (2)大多数蛋白质不能忍受60-80的高温， 而DNA在80 以上才变性。 (3)洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响,二、实验设计,（一）实验材料的选取,应选用DNA含量相对较高的生物组织，以便于降低实验难度，使得实验成功的可能性更大。,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞在蒸馏水中吸水涨破。 2、植物细胞破碎时需要先用洗涤剂溶解细胞膜,动物细胞的破碎,以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。,植物细胞的破碎,以洋葱为例，提取洋葱的DNA 时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。,（三）去除滤液中的杂质,为了纯化提取的DNA，需要将滤液进一步处理。,1、去除杂质方案一,利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不 同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。,在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度2mol/L， 过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液浓度0.14mol/L使DNA析出，过滤去除溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。,2、去除杂质方案二,直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。,3、去除杂质方案三,将滤液放在60-75的恒温水浴箱中保温10-15 min，注意严格控制温度范围。,A104-60-C3 循环恒温水浴箱,（四）DNA的析出与鉴定,1、析出DNA,将处理后的溶液过滤，加入与滤液等体积冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置23min，溶液中会出现白色丝状物，即粗提到的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分。,2、DNA的鉴定,取两支20mL的试管a和b，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入a试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管的溶液颜色的变化，试管a溶解DNA的溶液变蓝。,1、 在沸水浴中， DNA遇二苯胺会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,DNA的鉴定,2、甲基绿鉴定细胞内的DNA （呈绿色）,试管b 试管a,操作提示,以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入g柠檬酸钠，防止血液凝固。 加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。 二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,实验七 DNA的粗提取和鉴定 一、实验原理 1、利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。 2、利用DNA不溶于酒精溶液，某些蛋白能溶于其中。 3、利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性强。 二 实验设计注意的问题 1、实验材料应选用DNA含量相对较高的生物组织如鸡血，菜花 2、破碎细胞获取含DNA的滤液（动物细胞在蒸馏水中吸水涨破。植物细胞破碎时需要先用洗涤剂溶解细胞膜。） 3、去除滤液中的杂质 方法一：在2mol/L 的NaCl溶液DNA溶解，在 0.14mol/L的NaCl溶液中析出DNA，去除杂质。 方法二：直接在滤液中加入嫩肉粉，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质，过滤出DNA。 方法三：直接将滤液放在60-75的恒温水浴箱中保温破坏其他化合物，保留DNA。,4、DNA的析出与鉴定 （1）析出DNA 将处理后的DNA溶解液，加入与滤液等体积冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置23min，溶液中会出现白色丝状物，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分。即粗提到的DNA。 （2）DNA的鉴定 试管a：加入2mol/L的NaCl溶液5mL，放入丝状物使其溶解。加入4mL的二苯胺试剂。混匀后沸水浴热溶液变蓝。 试管b：加入2mol/L的NaCl溶液5mL，加入4mL的二苯胺试剂。混匀后沸水浴热溶液不变色。,