诊断学第三节骨髓细胞学检测

第三节 骨髓细胞学检测,主要内容,骨髓细胞形态学检查 细胞化学染色 细胞免疫学分型 细胞遗传学分析,形态学检查方法的价值,发现血细胞构成和形态异常 了解骨髓造血功能状态 对血液病提供确诊依据或提供重要线索 是各种血液病学检查的基础,骨髓细胞形态学检查,进行瑞氏染色 通过分析血液和骨髓中有核细胞数量、相对构成比、形态特征改变，了解骨髓造血功能状态和异常改变的形态学检查方法。,形态学检查方法的局限性,不能了解骨髓结构 不能了解细胞分子生物学特性和功能,骨髓细胞检查适应症,患者多次检查外周血有异常 患者有原因未明的肝、脾、淋巴结肿大 查明感染的原因 查明恶性肿瘤有无转移 助诊类脂质沉积病 对血液病进行鉴别诊断和疗效观察,骨髓血细胞检查禁忌症,凝血因子严重缺乏的出血性疾病，如血友病。 穿刺部位有炎症或畸形 晚期妊娠的妇女做髂骨穿刺要谨慎,第一部分,标 本 制 作,（一） 血液和骨髓标本的来源,部位：一般在髂前上棘或髂后上棘穿刺， 必要时行胸骨穿刺 骨髓穿刺成功的标志： 1.抽吸骨髓时患者感锐痛 2.骨髓液外观红色粘稠性、有骨髓小粒、油滴 3.显微镜下见有骨髓成分（如幼红细胞、幼粒细胞、巨核细胞、浆细胞、网状细胞等）,（二）瑞氏染色后，选择观察的部位,（三） 光学显微镜使用,显微镜使用注意事项 低倍镜（10倍）：判断取材、涂片、染色是否满意，小粒、油滴分级；骨髓增生程度；估计小粒造血细胞面积；计数全片巨核细胞数目；寻找瘤细胞团。 油镜下（100倍）：观察单个血细胞形态。,低倍镜判断骨髓增生程度,骨髓增生程度,极度活跃,明显活跃,增生减低,重度减低,增生活跃,血细胞发育过程中形态演变的一般规律 （一） 骨髓血细胞分化,正常情况下，在造血干细胞分化、发育、成熟的整个演变过程中，存在一定的规律性。造血干细胞逐级分化形成各系列、各阶段的骨髓血细胞，造血干、祖细胞在形态上无法鉴别，只有分化发育为各系列原始、幼稚细胞后，其形态学特征才较明显，才能辨认。,血细胞分化模式（供参考）,1-1 血细胞成熟过程规律,胞体：大小 （ 巨核 小大） 胞浆：细胞越幼稚，染色越深；细胞越成熟，染色 越浅淡，以胞浆染色判断有核红细胞、粒细 胞、巨核细胞成熟度。 胞浆染色：深蓝（原始）-蓝色（早幼）-浅蓝 （中幼）-粉色 颗粒变化：由无颗粒（原始）-噬天青颗粒（早 幼）-特异性颗粒（中性粒、嗜酸粒、嗜碱 粒）。 胞浆量： 有少-多,1-2细胞的发育规律,胞核： 体积：有大-小，成熟红细胞无核 染色质：细致疏松-粗糙紧密快状 核膜：不显著-显著 核仁：清楚-不清-消失 胞核与胞浆体积之比： 大-小 细胞发育成熟过程：由原始-早幼-中幼-晚幼-成熟细胞,以红细胞系统的成熟过程为例,1-3单个血细胞观察顺序,1. 细胞大小、形状 2. 胞浆量多少、颜色、颗粒、 3. 细胞核形状、染色质结构（粗细、凝聚） 4. 核仁数目、大小 5. 核、浆比例,（二）：各系列各阶段细胞形态,1.红细胞系统：临床四阶段划分 （原始红 ，早幼红，中幼红，晚幼红） 细胞的分化成熟本身是一个连续的过程，只是被人为地进行了定义分类而已。 红细胞系统占骨髓有核细胞1525,红细胞系统,原红细胞,中幼红细胞,晚幼红细胞,早幼红细胞,中幼红细胞,2 粒细胞系统,在正常骨髓中约占45%-70% 中性粒细胞在粒细胞系统占绝大部分， 嗜酸性粒细胞小于5%，嗜碱性粒细胞小于1%,粒细胞系统,原始粒细胞 早幼粒 中幼粒(特异性颗粒） 中性颗粒 嗜酸性颗粒 嗜碱性颗粒 中幼粒 中幼粒 中幼粒 晚幼粒 晚幼粒 晚幼粒 杆状核 杆状核 杆状核 分叶核 分叶核 分叶核,中性中幼,嗜碱中幼,嗜酸中幼,中性杆状,中性分叶,中性晚幼,3 淋巴细胞系统：,一般情况下，骨髓和外周血涂片为成熟淋巴细胞 淋巴细胞有多种形态,4. 巨核细胞系统,特点： 1.巨核细胞自原巨至裸核不做细胞整体分裂，仅仅是DNA的核内复制，染色体由2倍体可增至128倍体，细胞形态也由圆形变为不规则形，胞体明显由小到大。血小板的生成是巨核细胞走向解体的过程。 2.产生血小板的能力与其倍体数有关：倍体数越高产生血小板越多。一般从8倍体开始产生血小板，病理情况下可提前或不产生。 3.临床划分：原始巨核幼稚巨核成熟巨核（包括成熟有血小板形成巨核，成熟无血小板形成巨核）裸核血小板。,幼巨,产板巨,裸巨,颗粒巨,主要内容,骨髓细胞形态学检查 细胞化学染色 细胞免疫学分型 细胞遗传学分析,二、血细胞的细胞化学染色,过氧化物酶染色（POX） 中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP） 糖原染色（PAS） 铁染色（Fe）,髓过氧化物酶染色 （Myeloperoxidase，MPO）,1.血细胞所含过氧化物酶主要为髓过氧化物酶(MPO)，MPO是一类糖蛋白，相对分子质量约为150000，是人类中性粒细胞含量最多的蛋白质，约占细胞干重的3%5% 2.髓过氧化物酶是嗜天青颗粒中一种溶酶体酶，主要存在于线粒体和溶酶体中，主要功能是破坏生物氧化过程中有巨毒的过氧化物，使其放出氧，参加细胞内氧化还原过程，是一种与生物氧化有关的重要酶类,MPO正常参考结果,粒细胞系 原粒细胞呈阴性或弱阳性，阳性反应物为粗颗粒聚集状。自早幼粒细胞及以后各阶段中性粒细胞均为阳性反应，并随细胞成熟程度其反应渐加强，但衰老的细胞因过氧化酶活性降低而反应减弱。 嗜酸粒细胞为强阳性反应 嗜碱粒细胞呈阴性或弱阳性反应。,单核系MPO,原始单核细胞 溶解度很小，缺乏MPO活性，阴性或 弱阳性。 幼稚单核细胞 阴性或弱阳性反应。阳性反应物颗粒 细小,散在分布于细胞浆与细胞核上。,POX染色：中性粒细胞呈阳性；Auer小体呈阳性 原始细胞呈阴性,急性淋巴细胞白血病MPO阴性,临床意义,鉴别AML和ALL 急性粒细胞性白血病多呈强阳性反应 急性单核细胞白血病呈弱阳性或阴性反应 急性淋巴细胞白血病呈阴性反应,中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）,在中性粒细胞的特殊颗粒内，是中性粒细胞的标志酶，NAP的含量以晚幼和成熟粒细胞为最高,原粒NAP反应阴性,送检标本：外周血涂片 反应强度：-，1+，2+，3+，4+ 反应结果：阳性细胞百分率和积分值 成人NAP阳性率：10%-40%，阳性积分：40-80分,1+,3+,2+,4+,临床意义： 白细胞增高时，鉴别感染性疾病和CML,类白血病反应,CML,过碘酸 - 雪夫反应 periodic acid-schiff，PAS 又名糖原染色,糖原是人类的一种重要的贮存糖，如见于肝细胞内的。它是产生能量的重要物质，在化学上糖原是D-葡萄糖分子组成的聚合体,PAS染色阳性结果,阳性结果为胞质内出现粉 红色物质，细胞核为蓝色。 颗粒状 片状 珠状 块状,临床意义,是红系发育异常的证据 PAS对于鉴别白血病没有意义,铁染色,细胞外铁 细胞内铁：铁粒红细胞,正常骨髓（BM）中存在一定量的贮存铁，它以铁蛋白和含铁血黄素的形式存在，主要分布在网状细胞内，二者在铁被动员时，都能释放出铁，供血细胞利用以合成血红蛋白（Hb）。 骨髓中可染色铁的多少，通常认为可以代表贮存铁主要场所肝脏和全身单核巨噬细胞系统中铁的贮存情况。,细胞外铁,送检标本：骨髓涂片,细胞外铁,骨 髓 小 粒,在幼稚红细胞中有非血红素的含铁颗粒。BM中27-94%的中、晚幼红细胞 含有铁颗粒，又称铁粒幼红细胞。,细胞内铁,少数正常成熟红细胞也含有小颗 粒称铁粒红细胞。,铁粒红细胞,细胞外铁： 1+2+ 细胞内铁： 20%-90%，(平均65%）,正 常 值,临床意义：1.诊断缺铁性贫血的金标准； 2.贫血待查的重要鉴别诊断手段,再生障碍性贫血（AA）、巨幼红细胞性贫血、白血病、感染和多次输血病人。,铁高,诊断铁粒幼细胞贫血，难治性贫血伴环核铁粒幼细胞增多（MDS-RAS）,主要内容,骨髓细胞形态学检查 细胞化学染色 细胞免疫学分型 细胞遗传学分析,三、细胞免疫分型,免疫荧光法：直接荧光法；间接荧光法 （流式细胞学） 免疫酶染色法： （细胞免疫化学）,流式细胞学广泛应用于临床,1.有助于识别不同系列的细胞 2.识别不同的淋巴细胞 3.T淋巴细胞亚群 4.识别不同分化阶段的细胞 5.识别不同功能阶段的细胞 6.白血病的免疫表型分析 7.分离、分选、研究 8.白血病微小残留病检测,优点,单细胞悬液 多参数设定：细胞大小，胞浆颗粒，免疫表型（常规4色，最多12色标记） 操作简单，迅速分析,了解CD markers,T cell(Tiny):CD2,3,5,7;CD4,8;cCD3; B cell(big):CD19,20,22;cCD79a Myeloid(3rd):CD13,33;MPO Monocyte(4th):CD4,14,24,64 Blast:CD34,TdT,CD117 Mature lymphocytes: and Plasmal cells: c- and c-;CD138,CD38,病例：,骨髓增生重度减低； G=4.5%，E=0.5% 原始细胞占28%，胞体中等，胞浆量少，呈淡蓝色，胞核圆形，染色质细致，核仁显隐不一；POX染色：阴性,骨髓增生明显活跃 G=1%，E=3%，G/E=0.33:1 原始细胞占92%，胞体大小不等，胞浆量少，呈蓝色，胞核圆形，染色质细致，核仁显隐不一。POX染色：阴性,诊断：急性T/髓系双表型白血病,四、细胞遗传学分析,核型书写：染色体数目，性染色体，染色体异常 各项之间以逗号分开 性染色体以大写的X与Y表示 染色体变异以小写字母表示，t表示易位，inv表示倒位，ins表示插入，del表示缺失 p表示短臂，q表示长臂 完整核型书写：45,X,-Y,t(8;21),(q22,q22),送检标本,注意无菌操作 试管：肝素钠；禁忌：EDTA试管 迅速送检,