生物化学古练权版幻灯片

非水溶剂中的酶促反应,有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用,长期的观点认为:有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几乎毫无进展。这一观点直到1984年，非水溶剂中酶催化的研究才取得了突破性的进展。1984年美国Klibanov, A.M.在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述。 Klibanov等的工作在仅含微量水的有机介质(Microaqueous media)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。基于研究工作，libanov等提出只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。这一观点无疑是对酶只能在水溶液中起作用传统酶学思想的挑战,有机介质中的酶促反应概述,有机相酶反应的优点,有利于疏水性底物的反应。 可提高酶的热稳定性。 能催化在水中不能进行的反应。 可改变反应平衡移动方向。 可控制底物专一性。 可防止由水引起的副反应。 可扩大反应pH值的适应性。 酶易于实现固定化。 酶和产物易于回收。 可避免微生物污染。,有机相酶反应具备条件,保证必需水含量。 选择合适的酶及酶形式。 选择合适的溶剂及反应体系。 选择最佳pH值。,有机相酶反应的研究进展,超临界流体中的酶反应 仿水溶剂和印迹技术,超临界流体中的酶反应,指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。,超临界流体的有关性质,超临界流体的P-V-T性质,所谓超临界CO2是指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1，临界压力7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。 提高溶剂选择性的基本原则 操作温度和超临界流体的临界温度接近 超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质接近,超临界流体的有关性质,超临界流体萃取的应用实例,有机相酶反应的研究进展,超临界流体中的酶反应 仿水溶剂和印迹技术,仿水溶剂和印迹技术,仿水溶剂体系原理 分子印迹技术,仿水溶剂体系原理,可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。 极性添加剂对体系的影响 对反应体系内水的分配影响 与蛋白质的直接作用 对产物分配的影响 应用举例：通过适当地添加少量的DMF（二甲基酰胺），脂肪酶催化布洛芬与正丁醇酯化反应产物的得率从51%提高到91%，且反应活性也有所提高。,分子印迹技术,当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相同。 原理： 竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。 酶蛋白分子在有机相中具有对配体的“记忆”功能。,非水溶剂中的酶促反应,有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用,有机介质中酶促反应的条件,必需水 酶的选择 溶剂及反应体系的选择 pH选择和离子强度的影响,1.必需水,概念 紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量水。,1.必需水,影响酶反应体系中需水含量的因素 不同酶需水量不同。 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同，溶剂疏水性越强，需水量越少,2.酶的选择,酶种类的选择：脂肪酶、蛋白酶、次黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。除与酶有关，还与酶-底物、产物-溶剂间关系有关。 酶形式的选择 酶粉 例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应，发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。 化学修饰酶 例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。 固定化酶 把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高。,3.溶剂及反应体系的选择,水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙晴等 水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等 酶促反应有机介质体系： 单相共溶剂体系（水/水溶性有机熔剂） 两相体系（水/水不溶性有机溶剂） 低水有机溶剂体系（有机溶剂体系） 反胶束体系,反胶束体系概念和表面活性剂,反胶束体系概念 表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体。反胶束溶液是透明的热力学稳定的系统。 表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸-2-乙基酯磺酸钠。,有机溶剂影响酶催化的方式,有机溶剂能通过直接与酶相互作用引起抑制或失活 增大酶反应的活化能来降低酶反应速度。 降低中心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，使酶活性下降。 酶三级结构变化，间接改变酶活性中心结构影响失活。 有机溶剂与扩散的底物或产物相互作用而影响酶活 有机溶剂直接与酶附近的必需水相互作用,4.pH选择和离子强度的影响,pH选择：在有机溶剂的环境中，不会发生质子化及脱质子化的现象。酶在水相的pH值可在有机相中保持，同一种酶不同来源，对pH值敏感程度大不相同。 离子强度影响：随冻干时用的缓冲溶液离子强度增大，酶活会增大。,非水溶剂中的酶促反应,有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用,有机介质对酶性质的影响,稳定性 活性 专一性 反应平衡方向,1.稳定性,热稳定性提高和储存稳定性提高 结论：在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关；一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。,2.活性,刚-柔并存 刚性：生物大分子结构的精确性 柔性：生物大分子局部区域具有一定的可运动性。 （1）单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响 有机溶剂直接作用于酶。 有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。 （2）低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化。 例 有人对吸附在不同载体上的胰凝乳蛋白酶或乙酸脱氢酶在各种水活度下的酶活性研究表明，酶活性随水活度大小而变化，在一定水活度下，酶活性随载体不同而变化。,2.活性,（3）在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。 认为： 超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引起。 根据 ： 微团水化程度（W）（W=H2O/表面活性剂）的最佳值和酶活性的最大值呈正相关 W值最佳时，微团内径总是相当于被包裹的酶分子直径,3.专一性,某些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。 有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。,酶活性丧失的可能原因,4.反应平衡方向,非水溶剂中的酶促反应,有机介质中的酶促反应概述 有机介质中反应的条件 有机介质对酶性质的影响 有机介质中酶催化的应用,有机介质中酶催化的应用,手性药物的拆分,概念： 手性化合物是指化学组成相同，而其立体结构互为对映体的两种异构体化合物。 手性药物两种对映体的药效差异 一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效 一种有显著疗效，另一种有毒副作用 两种对映体的药效相反 两种对映体具有各自不同的药效 两种消旋体的作用具有互补性,手性药物的拆分方法,分为：非生物法、生物法 非生物法（机械分离法、形成和分离对映体异构法、色谱分离法、动力学拆分） 生物拆分法原理 实质即两个对映体竞争酶的同一个活性中心位置，两者的反应速率不同，产生选择性，从而使反应产物具有光学活性。 青霉素酰化酶及其催化作用：利用其底物专一性及对映体的选择性进行光学异构体的合成与拆分。,2、手性高分子聚合物的制备 (1) 可生物降解的聚酯的合成 (2) 糖脂的合成 3、酚树脂的合成 如辣根过氧化物酶在二氧六环与水混溶的均一介质体系中，可以催化苯酚等酚类物质聚合，生成酚类聚合物。 4、导电有机聚合物的合成 如辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生成聚苯胺。 5、发光有机聚合物的合成 如辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯基苯酚合成聚对苯基苯酚，将这种聚合物制成二极管，可以发出蓝光。 6、食品添加剂的生产 如利用芳香醛脱氢酶生成香兰素。 7、甾体转化 如可的松转化为氢化可的松的酶促反应，在水-乙酸丁酯或水-乙酸乙酯组成的系统中，转化率高达100%和90%。 8、生物能源 如生物柴油。,有机溶剂中的酶促反应,C-O键的形成 C-N键的反应，肽的合成 C-C键的形成 还原反应 氧化反应 异构化反应 C-X的反应卤化反应,C-O键的形成,酯类：酯酶和脂肪酶可催化酯合成反应、转酯反应和酸酐水解反应。 环氧化合物 糖苷键的水解和形成 加氧氧化反应,酯合成反应,转酯反应,酸酐水解,环氧化合反应,糖的焦磷酸化，糖的异构化,糖的衍生物,醇解,加氧氧化反应,有机溶剂中的酶促反应,C-O键的形成 C-N键的反应，肽的合成 C-C键的形成 还原反应 氧化反应 异构化反应 C-X的反应卤化反应,C-N键的反应，肽的合成,有机溶剂中的酶促反应,C-O键的形成 C-N键的反应，肽的合成 C-C键的形成 还原反应 氧化反应 异构化反应 C-X的反应卤化反应,C-C键的形成,羟醛反应 酮醛和羟醛转移反应 醛缩合反应 乙酰辅酶A参与的C-C键构成反应 醛加成反应,（1）羟醛反应,（2）酮醛和羟醛转移反应,（3）醛缩合反应,（4）乙酰辅酶A参与的C-C键构成反应,（5）醛加成反应,有机溶剂中的酶促反应,C-O键的形成 C-N键的反应，肽的合成 C-C键的形成 还原反应 氧化反应 异构化反应 C-X的反应卤化反应,还原反应,有机溶剂中的酶促反应,C-O键的形成 C-N键的反应，肽的合成 C-C键的形成 还原反应 氧化反应 异构化反应 C-X的反应卤化反应,氧化反应,（1）C-H, C=C 氧化 （2）醇氧化 （3）苯酚氧化 （4）羧酸氧化 （5）C-N氧化,（） C-H, C=C 氧化,（） 醇氧化,（3）苯酚氧化,（） 羧酸氧化,（5）C-N氧化,有机溶剂中的酶促反应,C-O键的形成 C-N键的反应，肽的合成 C-C键的形成 还原反应 氧化反应 异构化反应 C-X的反应卤化反应,异构化反应,有机溶剂中的酶促反应,C-O键的形成 C-N键的反应，肽的合成 C-C键的形成 还原反应 氧化反应 异构化反应 C-X的反应卤化反应,C-X的反应卤化反应,酶工程,酶工程的定义 化学酶工程 固定化酶 生物酶工程 酶工程的应用范围,酶工程的定义,酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需的产品。 酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术，它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。,酶工程,酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。酶工程主要采用两种方法。一是化学酶工程，即通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶；另一种是生物酶工程，即用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新