实验二 质粒dna的酶切鉴定

实验二 质粒DNA的酶切鉴定 及琼脂糖凝胶电泳,1. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。,2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。,1) 寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： 型 型* 型,第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。,第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5 G AATTC 3 3 C TTAA G 5 从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 切割后形成5 GAT和ATC 3、 3 CTA和TAG 5。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,第三类（ III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。,3) 限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。,4) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。,实验材料和试剂,实验材料： 质粒DNA：上周实验课提取纯化。 实验试剂： 酶及其酶切缓冲液：购买成品。 酶及其酶切缓冲液：购买成品。 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。,实验仪器,恒温水浴锅,反应 10×K Buffer 2L 质粒DNA 16L Xho I 1L BamH I 1L,(2)用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底,(3)混匀反应体系后，37水浴保温2-3h,(1)EP管编号, 加样,实验步骤,反应 10×K Buffer 2L 质粒DNA 16L Hind III 2L,电泳检测示例,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。 影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的燃料以及电泳缓冲液的组成。,琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片段。0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨1-25kb的片段；0.5% 的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的DNA (20-100kb）；对于小片段的DNA(0.2-2kb) 可用1.5%或更高浓度的凝胶进行分离。不过，以上这些并不是绝对的，因为有时我们需要同时分离多种分子量相差较大的片段，因此所用琼脂糖凝胶的浓度要视情况而定。,EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA。 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套。,3. 【实验仪器与试剂】 试剂 质粒 NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder) EcoR1 和 Xho1 核酸内切酶（Takara） EcoR 1和 Xho 1酶解缓冲液(10×H buffer) 琼脂糖,TBE或TAE缓冲液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上样液(6×)：0.25% 溴酚兰，40(W/V)蔗糖 水溶液或30的甘油。,实验仪器 1、微量移液器 2、离心机 3、恒温水浴箱,DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。,质粒,如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。,2kb DNA Ladder不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。,片段,碱基对,1,2000,2,1000,3,750,4,500,5,250,6,100,EcoR I 酶切位点：G'AATT_C Xho I 酶切位点：C'TCGA_G 10×H buffer: 500mM Tris-HCl(pH7.5) 100mM MgCl2 10mM Dithiothreitol 1000mM NaCl,酶活性的定义： 一个活性单位（U)，是指在50l反应体系中，37oC的条件下，经过1小时的反应时间，将1g DNA 完全酶解所需要的酶量。 因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。,电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等,4. 实验方法和步骤,* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用 H buffer。,置于37水浴酶解0.5-1小时。酶解完成后，分别加入10l 10倍的上样缓冲液, 然后各取15l进行电泳分析。,1) 质粒DNA的酶切（自提质粒）,【酶切的实验步骤】 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：,2、将反应物置于37水浴，温浴13小时。 3、加入5 µl加样缓冲液，混匀后即可加样进行电泳。 4、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。,2) 琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶液的制备：称取0.15g琼脂糖，置于三角瓶中，加入15ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。,3）胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。,将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层,然后放入电泳梳。 室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸） 或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。,4）加样 用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约510 l。 2 kb DNA ladder（共6条带）: 在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入2l 的 2 kb DNA ladder（50ng/l ）。,5）电泳（带上手套操作） 加完样后的凝胶板即可通电进行电泳； 建议在100120V的电压下电泳； 当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳； 扫胶仪扫胶，拍片保存。,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4进行电泳以增加凝胶硬度。,6）观察与拍照 在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。,对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。,再次强调_,Relaxed circle,Linearized form,Super-coiled form,【思考题】 1、影响限制性酶切的因素有哪些？ 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 3